불꽃을 침묵 : 약한 전기 물고기에서 CRISPR / Cas9 게놈 편집
Summary
여기서, CRISPR/Cas9 게놈 녹아웃 전기 물고기를 생산하고 후방에 프로토콜이 제시된다. 상세히 설명된 것은 체육관 및 모르미리드 모두에 필요한 분자 생물학, 사육 및 축산 요구 사항, 및 Cas9-유도 인델 F0 애벌레를 생산하는 주입 기술이다.
Abstract
전기 수신 및 전기 발생은 척추 동물의 진화 역사에서 변경되었습니다. 일반적인 유전 아키텍처를 공유하는 이 독립적으로 파생된 표현형에는 수렴의 현저한 정도가 있습니다. 이것은 아마도 가장 좋은 체육관과 mormyrids의 수많은 수렴 기능에 의해 예시, 생산 하 고 약한 전기 물고기 라고 하는 두 종 풍부한 teleost clades. 약한 전기 물고기가 주변 을 감지하고 의사 소통하기 위해 전기를 사용하는 발견 이후 50 년 동안, 과학자의 성장 커뮤니티는 개발, 시스템 및 회로 신경 과학의 진화에 엄청난 통찰력을 얻고있다, 세포 생리학, 생태학, 진화 생물학 및 행동. 최근에는 전기 어류에 대한 게놈 자원이 확산되고 있습니다. 이 자원의 사용은 이미 이 종에 있는 유전자형과 표현형 사이 연결에 관하여 중요한 통찰력을 촉진했습니다. 유전체학 데이터를 약한 전기 어류의 자형적 데이터와 통합하는 데 큰 장애물은 기능성 유전체학 도구가 부족하다는 것입니다. 우리는 약한 전기 물고기에 있는 내인성 DNA 복구 기계장치를 이용하는 CRISPR/Cas9 돌연변이 발생을 능력을 발휘하기 위한 가득 차있는 프로토콜을 여기에서 보고합니다. 우리는 이 프로토콜이 CRISPR/Cas9를 사용하여 인델과 포인트 돌연변이를 표적으로 하여 모미리드 종 브리아노미러스 brachyistius와 체육관 브라키하이포무스 고데리오 모두에서 동등하게 효과적이라는 것을 입증합니다. 나트륨 채널 유전자 scn4aa. 이 프로토콜을 사용하여, 두 종으로부터의 배아를 수득하고 유전자형화하여 나트륨 채널 scn4aa의 제1 엑소에서 예측된 돌연변이가 존재했다는 것을 확인하였다. 녹아웃 성공 표현형은 주입되지 않은 크기 일치 대조군과 비교할 때 감소된 전기 기관 방전 진폭을 보여주는 기록으로 확인되었다.
Introduction
전기 수신 및 전기 발생은 척추 동물의 진화 역사에서 변경되었습니다. 텔레오스트 물고기, 골테오그로시포메 및 실리리폼의 두 계보, 병렬로 진화된 전기 수신, 텔레오스트의 다섯 계보(체육관, 모르미리드, 그리고 제네라 아스트로스코푸스, 말라프테루스, 시노돈티스) 병렬로 진화 전기 발생. 이러한 독립적으로 파생된 표현형에는 공통의 유전 아키텍처1,2,3을공유하는 수렴정도가 눈에 띄는 정도이다.
이것은 아마도 가장 좋은 체육관과 mormyrids의 수많은 수렴 기능에 의해 예시, 생산 하 고 약한 전기 물고기 라고 하는 두 종 풍부한 teleost clades, 약한 전기 물고기 라고. 약한 전기 물고기가 주변을 감지하고의사소통하기 위해 전기를 사용하는 발견 이후 50 년 동안, 과학자의 성장 커뮤니티는 개발1,5의 진화에 엄청난 통찰력을 얻고있다 ,6, 시스템 및 회로 신경 과학7,8,9,10,세포 생리학11,12,생태 및 에너지13 ,14,15,16,17, 동작18,19, 및 매크로 진화3,20,21 .
최근에는 전기어류1,22,23,24,25,26, 27,28. 이러한 자원의 사용은 이미 이 종1, 2,3,28,29에서 유전자형과 표현형 사이의 연결에 관한 중요한 통찰력을 생성했습니다. ,30. 유전체학 데이터를 약한 전기 어류의 자형적 데이터와 통합하는 데 큰 장애물은 기능성 유전체학도구(31)의현재 부족이다.
이러한 도구 중 하나는 Cas9 엔도너첼리스(CRISPR/Cas9, CRISPR) 기법과 결합된 최근 개발된 클러스터된 정규 간격 짧은 Palindromic 반복입니다. CRISPR/Cas9는 모델32,33,34 및 비모델 유기체35,36,37 모두에서 광범위하게 사용되었던 게놈 편집 도구입니다. CRISPR/Cas9 기술은 비복제 방법38을사용하여 저렴한 비용으로 기본 분자 생물학이 가능한 실험실에서 짧은 가이드 RNA(sgRNAs)라고 불리는 유전자 특이적 프로브를 쉽게 생성할 수 있는 지점으로 발전했습니다. CRISPR은 모폴리노스39,40,전사 활성제 와 같은 이펙터 뉴클레아제(TALENs) 및 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)와 같은 다른 녹아웃/녹다운 전략에 비해 비용이 많이 들고 모든 표적 유전자를 생성하는 데 시간이 많이 걸립니다.
CRISPR/Cas9 시스템은 sgRNA 서열에 의해 지시된 게놈의 특정 영역을 표적으로 하고, 이중 가닥 중단을 일으키는 원인이 되어 유전자 녹아웃을 생성하기 위하여 기능합니다. 이중 가닥 휴식은 세포에 의해 검출되고 비상동종 종단 접합(NHEJ) 경로를 우선적으로 사용하여 내인성 DNA 복구 메커니즘을 유발합니다. 이 통로는 높게 오류가 발생하기 쉽습니다: 복구 프로세스 도중, DNA 분자는 수시로 이중 좌초 된 중단 사이트에 삽입 또는 삭제 (indels)를 통합할 것입니다. 이러한 인델은 (1) 개방 판독 프레임의 이동, (2) 조기 정지 코돈의 삽입, 또는 (3) 유전자 생성물의 중요한 1차 구조의 이동으로 인해 기능의 손실을 초래할 수 있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 약한 전기 물고기 종에 있는 NHEJ를 사용하여 표적 유전자에 있는 표적 점 돌연변이를 표적으로 하기 위하여 CRISPR/Cas9 편집을 이용합니다. 다른 기술보다 간단하고 효율적이지만, 돌연변이 발생의이 방법은 유전 모자이크41,42,43에 기인하는 F 0에서 현상형 경건의 범위를 초래할 것으로 예상된다 ,44.
유기체의 선택
약한 전기 물고기의 비교 유전체학에 대한 미래 연구를 촉진하기 위해 프로토콜 개발을위한 체육관 및 mormyrids 모두에 대한 대표적인 종을 선택해야합니다. 우루과이 몬테비데오에서 열린 2016 년 전기 물고기 회의에서 논의 한 후, 이미 실험실에서 사육 될 수있는 종을 활용하고 유전체 자원을 사용할 수있는 종을 활용하기 위한 지역 사회의 합의가 있었습니다. 체육관 브라키하이포무스 가우디오와 모르미리드 브리노미러스 브라키시스티우스는 이러한 기준에 맞는 종으로 선정되었다. 두 종 모두에서 번식 조건을 유도하고 유지하는 자연 신호는 포로로 모방하기 쉽습니다. B. gauderio,남미에서 체육관 종, 낮은 축산 요구 사항의 장점을 가지고 : 물고기는 상대적으로 작은 (4 L) 탱크에서 상대적으로 높은 밀도로 유지 될 수있다. B. gauderio는 또한 포로 조건하에서 빠른 세대 회전율을 가지고있습니다. 실험실 조건에서, B. gauderio 약에 계란에서 성인으로 개발할 수 있습니다 4 개월.
B. brachyistius, 서중앙 아프리카에서 모미리드 물고기의 종, 포로에서 쉽게 품종. B. brachyistius는 수족관 무역을 통해 쉽게 사용할 수 있으며, 많은 연구에서 널리 사용되어 왔으며, 현재 는 다수의 유전체 자원을 사용할 수 있습니다. 그들의 수명 주기는 실험실 조건에 따라 1-3 년 동안 지속됩니다. 축산 요구 사항은 이 종에 대해 다소 더 집중적이며, 사육 중 침략으로 인해 적당한 크기의 탱크 (50−100 L)가 필요합니다.
전기 물고기의 그밖 종을 공부하는 실험실은 종을 사육할 수 있는 한 이 프로토콜을 쉽게 적응할 수 있어야 하고, 단세포 배아는 성인으로 집합되고 양육될 수 있습니다. 주택, 애벌레 축산, 체외 수정 (IVF) 비율은 가능성이 다른 종으로 변경됩니다; 그러나,이 프로토콜은 다른 약한 전기 물고기의 번식 시도를위한 출발점으로 사용할 수 있습니다.
개념 증명을 위한 이상적인 유전자 표적: scn4aa
약한 전기 mormyrid 및 체육관 물고기는 전기 기관이라고 하는 특수 기관을 방전해서 전기장 (전기 발생)을 생성합니다. 전기 기관 방전 (EODs)는 전기 세포라는 전기 기관 세포에서 활동 전위가 동시에 생성되어 발생합니다. EOD는 물고기의 주변의 고해상도 전기 이미지를 만들기 위해 피부에 전기 수용체의 배열에 의해검출된다 45. 약한 전기 물고기는 또한 그들의 conspecifics의 EOD 파형의 기능을 감지 할 수 있습니다18 뿐만 아니라 그들의 방전 속도46,EOD는 새소리 또는 개구리와 유사한 소셜 통신 신호로 추가로 작동 할 수 있도록 발성47.
모르마이리드와 체육관의 전위 전위 생성의 주요 구성 요소는 전압 게이트 나트륨 채널 NaV1.42입니다. 비전기 텔레오스스트는 전압 게이트 나트륨 채널 NaV1.430에대한 코딩, 두 개의 paralogous 유전자 사본을 표현, scn4aa 및 scn4ab. 체육관에서 약하게 전기 물고기 혈통 모두에서, scn4aa는 급속하게 진화하고 그것의 운동 특성에 영향을 미치는 수많은 아미노산 치환을 겪었다48. 가장 중요한 것은, scn4aa는 전기 기관2,3에두 계보에서 구획화되고있다. 전기 기관에 scn4aa의 상대적으로 제한 된 발현, 뿐만 아니라 EODs의 생성에 그것의 중요 한 역할, 그것은 CRISPR/Cas9 녹아웃 실험에 대 한 이상적인 대상, 그것은 최소한의 해로운 pleiotropic 효과. 약한 전기 물고기는 그들의 애벌레 전기 기관을 배출 하기 시작 하기 때문에 6-8 일 후 수정 (DPF), scn4aaa의 타겟팅은 이상적으로 배아 미세 주입 다음 빠른 자형질에 적합.
Protocol
Representative Results
Discussion
약한 전기 물고기의 현상학적 풍요로움은 유전체학 자원의 최근 확산과 함께, 약한 전기 물고기 모델에서 기능적 유전체 도구에 대한 강력한 필요성을 동기를 부여합니다. 이 시스템은 실험실에서 쉽게 보관되는 물고기의 병렬 계보에서 수많은 현상형 특성의 수렴 진화로 인해 특히 매력적입니다.
여기에 설명된 프로토콜은 전기 발생과 전기 수신을 병렬로 진화시킨 약한 전…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 모니카 루카스, 캐서린 쇼, 라이언 테일러, 제러드 톰슨, 니콜 로비쇼, 호프 힐리가 물고기 사육, 데이터 수집 및 초기 프로토콜 개발에 도움을 준 영웅적인 노력을 인정한다. 우리는 또한 원고에 대한 그들의 제안에 대한 세 검토자에게 감사드립니다. 우리는 그들의 의견을 해결 한 후 더 나은 품질의 최종 제품을 믿습니다. 이 작품은 국립 과학 재단 #1644965 JRG에 #1455405 지원, 그리고 VLS에 자연 과학 및 공학 연구 위원회 DG 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| 20 mg/mL RNA grade Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
| 50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
| borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length) |
| Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
| Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | 10289651 | |
| Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14-824-654 | referred to as "precision glass syringe" in the protocol |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | referred to as "delicate task wipe" in the protocol |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| NEBuffer 3 | NEB | B7003S | used for in vitro cleavage assay |
| OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
| Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | referred to as "spawning agent" in the protocol |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | referred to as "thermoplastic" in the protocol |
| Pipette puller | WPI | SU-P97 | sutter brand |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Reusable needle- requires customization | Fisher Scientific | 7803-02 | Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25 |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | Use with the 10X NEB buffer that is included |
| Teflon coated tools | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol |
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