Здесь представлен протокол для производства и заднего CRISPR/Cas9 генома нокаут электрической рыбы. Изложены в деталях являются необходимые молекулярной биологии, селекции, и животноводство требования как для gymnotiform и mormyrid, и инъекционные методы для производства Cas9 индуцированных indel F0 личинок.
Электроприем и электрогенез изменились в эволюционной истории позвоночных. Существует поразительная степень конвергенции в этих независимо полученных фенотипов, которые имеют общую генетическую архитектуру. Это, пожалуй, лучше всего иллюстрируется многочисленными конвергентными особенностями гимнотиформ и мормиридов, двух богатых видов телеостовых кладок, которые производят и обнаруживают слабые электрические поля и называются слабо электрическими рыбами. За 50 лет, прошедших с момента открытия, что слабо электрические рыбы используют электричество, чтобы почувствовать свое окружение и общаться, растущее сообщество ученых получило огромное понимание эволюции развития, систем и схем нейронауки, клеточной физиологии, экологии, эволюционной биологии и поведения. В последнее время наблюдается распространение геномных ресурсов для электрической рыбы. Использование этих ресурсов уже способствовало получению важных сведений о связи между генотипом и фенотипом этих видов. Основным препятствием для интеграции данных геномики с фенотипическими данными слабоэлектрической рыбы является отсутствие функциональных инструментов геномики. Мы сообщаем здесь полный протокол для выполнения CRISPR/Cas9 мутагенеза, который использует эндогенные механизмы репарации ДНК в слабо электрических рыб. Мы демонстрируем, что этот протокол одинаково эффективен как в мормиридных видах Brienomyrus brachyistius, так и в gymnotiform Brachyhypopomus gauderio с помощью CRISPR/Cas9 для целевой indels и точечных мутаций в первом экзоне натриевый канал гена scn4aa. Используя этот протокол, эмбрионы обоих видов были получены и генотипированы, чтобы подтвердить, что прогнозируемые мутации в первом экзоне канала натрия scn4aa присутствовали. Плей-аут успеха фенотип был подтвержден с записями, показывающими снижение электрических амплитуды разряда органов по сравнению с невведенным размером соответствующих элементов управления.
Электроприем и электрогенез изменились в эволюционной истории позвоночных. Две линии телеостных рыб, остеоглоссиформы и силуриформы, развивались электроприем параллельно, и пять линий телеост (гимназии, мормириды, и род Астроскопус, Малаптерурус, и Synodontis) развивался электрогенез параллельно. Существует поразительная степень конвергенции в этих независимо полученных фенотипов, которые имеют общую генетическую архитектуру1,2,3.
Это, пожалуй, лучше всего иллюстрируется многочисленными конвергентными особенностями гимнотиформ и мормиридов, двух богатых видов телеостовых кладок, которые производят и обнаруживают слабые электрические поля и называются слабо электрическими рыбами. В 50 лет с момента открытия, что слабо электрические рыбы используют электричество, чтобы почувствовать свое окружение и общаться4, растущее сообщество ученых получил огромное понимание эволюции развития1,5 ,6, системы и схемы нейробиологии7,8,9,10, клеточной физиологии11,12, экологии и энергетики13 ,14,15,16,17, поведение18,19, и макроэволюция3,20,21 .
В последнее время наблюдается распространение геномных, транскриптомических и протеомных ресурсов для электрической рыбы1,22,23,24,25,26, 27,28. Использование этих ресурсов уже дало важные идеи относительно связи между генотипом и фенотипом у этих видов1,2,3,28,29 ,30. Основным препятствием для интеграции данных геномики с фенотипическими данными слабоэлектрической рыбы является отсутствие функциональных инструментов геномики31.
Одним из таких инструментов является недавно разработанный кластерных регулярно межпространственных коротких palindromic Повторы в паре с Cas9 эндонуклеазы (CRISPR/Cas9, CRISPR) техники. CRISPR/Cas9 является инструментом редактирования генома, который вошел широкое применение в обеих моделей32,33,34 и не-модель организмов35,36,37, так. Технология CRISPR/Cas9 продвинулась до такой степени, что лаборатория, способная к базовой молекулярной биологии, может легко генерировать генно-специфические зонды, называемые короткими направляющими РНК (sgRNAs), по низкой цене с использованием метода неклонирования38. CRISPR имеет преимущества по сравнению с другими стратегиями нокаута/нокдауна, такими как морфолинос39,40, транскрипционный активатор-подобный эффектор nucleases (TALENs), и цинковый палец nucleases (ЗФНС), которые являются дорогостоящими и много времени для генерации для каждого целевого гена.
Система CRISPR/Cas9 функционирует для создания генных нокаутов, ориентируясь на определенную область генома, направленную последовательностью sgRNA, и вызывая двухцепочечный разрыв. Двухцепочечный разрыв обнаруживается клеткой и вызывает эндогенные механизмы репарации ДНК, преимущественно используя негомологичные конечные соединения (NHEJ). Этот путь очень подвержен ошибкам: во время процесса ремонта молекула ДНК часто включает вставки или удаления (индельи) в двухцепочечном месте разрыва. Эти indels могут привести к потере функции из-за либо (1) сдвиги в открытой раме чтения, (2) вставки преждевременной остановки кодона, или (3) сдвиги в критической первичной структуре гена продукта. В этом протоколе мы используем редактирование CRISPR/Cas9 для целевых точечных мутаций в генах-мишенях, используя NHEJ у слабо электрических видов рыб. Хотя проще и эффективнее, чем другие методы, этот метод мутагенеза, как ожидается, приведет к ряду фенотипических разрывов в F0, который приписывается генетический мозаичный41,42,43 ,44.
Выбор организмов
Для содействия будущим исследованиям по сравнительной геномике слабо электрических рыб необходимо было отобрать представительный вид как для гимназиформ, так и для мормиридов для разработки протокола. После обсуждения в ходе совещания «Электрические рыбы» в Монтевидео, Уругвай, в 2016 году был достигнут консенсус сообщества в отношении использования видов, которые уже могут быть выведены в лаборатории и которые имеют сявко. Тренажерный зал Brachyhypopomus gauderio и mormyrid Brienomyrus brachyistius были выбраны в качестве видов, которые соответствуют этим критериям. В обоих видах, естественные сигналы для индуцирования и поддержания условий размножения легко имитировать в неволе. B. gauderio, gymnotiform видов из южной Америки, имеет преимущество низких требований к животноводству: рыба может храниться при относительно высокой плотности в относительно небольших (4 L) танков. B. gauderio также имеет быстрый оборот поколений в условияхневоле. В лабораторных условиях, B. gauderio может развиваться от яйца к взрослому примерно в 4 месяца.
B. brachyistius, вид мормиридных рыб из Западно-Центральной Африки, легко размножается в неволе. B. brachyistius легко доступен через аквариум торговли, был широко использован во многих исследованиях, и в настоящее время имеет ряд геномных ресурсов. Их жизненный цикл составляет 1–3 года, в зависимости от лабораторных условий. Требования к животноводству несколько более интенсивны для этого вида, требуя средних размеров танков (50–100 л) из-за их агрессии во время размножения.
Лаборатории, изучающие другие виды электрических рыб, должны быть в состоянии легко адаптировать этот протокол до тех пор, пока вид может быть выведен, и одноклеточные эмбрионы могут быть собраны и воспитаны во взрослую жизнь. С другими видами, скорее всего, изменятся показатели жилищного строительства, личинки и экстракорпорального оплодотворения (ЭКО); однако, этот протокол может быть использован в качестве отправной точки для размножения попыток в других слабо электрических рыб.
Идеальный ген Целевой для доказательства концепции: scn4aa
Слабо электрические мормиридные и gymnotiform рыбы генерировать электрические поля (электрогенез) путем разрядки специализированного органа, называемого электрическим органом. Электрические разряды органов (EOD) являются результатом одновременного производства потенциалов действия в клетках электрических органов, называемых электроцитами. EODs обнаружены массив электрорецепторов в коже для создания высокого разрешения электрических изображений окружения рыбы45. Слабо электрические рыбы также способны обнаруживать особенности eOD волновых форм их conspecifics18, а также их скорость разряда46,что позволяет EODs функционировать дополнительно в качестве сигнала социальной связи, аналогичной пение птиц или лягушки вокализации47.
Основным компонентом действия потенциального поколения в электроцитах как мормирид, так и gymnotiform слабо электрической рыбы является напряжение-gated натриевый канал NaV1.42. Неэлектрические телеост выражают две паралогические копии генов, scn4aa и scn4ab, кодирование для натриевого канала NaV1.430. В обоих gymnotiform и mormyrid слабо электрических линий рыбы, scn4aa развивалась быстро и претерпела многочисленные аминокислотные замены, которые влияют на его кинетические свойства48. Самое главное, scn4aa стала разобщена в обеих линиях к электрическому органу2,3. Относительно ограниченное выражение scn4aa к электрическому органу, а также его ключевая роль в генерации EODs, делает его идеальной мишенью для экспериментов по нокауту CRISPR/Cas9, так как он имеет минимальные пагубные плейотропные эффекты. Поскольку слабо электрические рыбы начинают выгрузку своих личинок электрических органов 6-8 дней после оплодотворения (DPF), ориентация scn4aa идеально подходит для быстрого фенотипирования после микроинъекции эмбриона.
Фенотипическое богатство слабоэлектрической рыбы, наряду с недавним распространением ресурсов геномики, мотивирует острую потребность в функциональных геномных инструментах в слабо электрической модели рыб. Эта система особенно привлекательна из-за конвергентной эволюции многочи?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы признают героические усилия Моники Лукас, Кэтрин Шоу, Райана Тейлора, Джареда Томпсона, Николь Робишо и Хоуп Хили за помощь в размножеству рыб, сборе данных и разработке раннего протокола. Мы также хотели бы поблагодарить трех рецензентов за их предложения по рукописи. Мы считаем, что конечный продукт будет лучшего качества после рассмотрения их замечаний. Эта работа была профинансирована за счет поддержки Со стороны Национального научного фонда #1644965 и #1455405 JRG, а также Грант Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям DG для VLS.
20 mg/mL RNA grade Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length) |
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | 10289651 | |
Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14-824-654 | referred to as "precision glass syringe" in the protocol |
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | referred to as "delicate task wipe" in the protocol |
MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
NEBuffer 3 | NEB | B7003S | used for in vitro cleavage assay |
OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | referred to as "spawning agent" in the protocol |
Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | referred to as "thermoplastic" in the protocol |
Pipette puller | WPI | SU-P97 | sutter brand |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
Reusable needle- requires customization | Fisher Scientific | 7803-02 | Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25 |
T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | Use with the 10X NEB buffer that is included |
Teflon coated tools | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol |