Deaktivere spark: CRISPR/Cas9 Genova redigere i svakt Electric Fish
Summary
Her er en protokoll presentert for å produsere og bak CRISPR/Cas9 Genova knockout elektrisk fisk. Skissert i detalj er nødvendig molekylærbiologi, avl og oppdrett krav til både en gymnotiform og en mormyrid, og injeksjon teknikker for å produsere Cas9-indusert indel F0 larver.
Abstract
Electroreception og electrogenesis har endret seg i evolusjons historien til virveldyr. Det er en slående grad av konvergens i disse uavhengig avledet fenotyper, som deler en felles genetisk arkitektur. Dette er kanskje best illustrert av de mange konvergent funksjonene i gymnotiforms og mormyrids, to arter-rik tetramerisk klader som produserer og oppdager svake elektriske felt og kalles svakt elektrisk fisk. I 50 år siden oppdagelsen at svakt elektrisk fisk bruker elektrisitet til å fornemme sine omgivelser og kommunisere, et voksende fellesskap av forskere har fått enorm innsikt i utviklingen av utvikling, systemer og kretser nevrovitenskap, cellulære fysiologi, økologi, evolusjonære biologi og atferd. Flere nylig har det vært en spredning av genomisk ressurser for elektrisk fisk. Bruk av disse ressursene har allerede tilrettelagt viktig innsikt med hensyn til sammenhengen mellom genotype og fenotype i disse artene. Et stort hinder for å integrere Genomics data med fenotypiske data av svakt elektrisk fisk er en gave mangel på funksjonelle Genomics verktøy. Vi rapporterer her en full protokoll for å utføre CRISPR/Cas9 mutagenese som utnytter endogene DNA reparasjon mekanismer i svakt elektrisk fisk. Vi viser at denne protokollen er like effektiv i både mormyrid arter Brienomyrus brachyistius og gymnotiform Brachyhypopomus GAUDERIO ved hjelp CRISPR/Cas9 å målrette indeler og punkt mutasjoner i den første ekson av natrium kanal gen scn4aa. Ved hjelp av denne protokollen ble embryo fra begge artene innhentet og genotyped for å bekrefte at de anslåtte mutasjoner i den første ekson av natrium kanalen scn4aa var til stede. Den Knock-Out suksess fenotype ble bekreftet med opptak viser redusert elektrisk organ utladning amplituder sammenlignet med uninjected størrelse matchet kontroller.
Introduction
Electroreception og electrogenesis har endret seg i evolusjons historien til virveldyr. To linjene av tetramerisk fisk, visninger og Maller, utviklet electroreception parallelt, og fem linjene av teleosts (Gymnotiformes, mormyrids, og slekter Astroscopus, Malapterurus og Synodontis) utviklet seg electrogenesis parallelt. Det er en slående grad av konvergens i disse uavhengig avledet fenotyper, som deler en felles genetisk arkitektur1,2,3.
Dette er kanskje best illustrert av de mange konvergent funksjonene i gymnotiforms og mormyrids, to arter-rik tetramerisk klader, som produserer og oppdager svake elektriske felt og kalles svakt elektrisk fisk. I 50 år siden oppdagelsen at svakt elektrisk fisk bruker elektrisitet til å fornemme sine omgivelser og kommunisere4, et voksende fellesskap av forskere har fått enorm innsikt i utviklingen av utviklingen1,5 ,6, systemer og kretser nevrovitenskap7,8,9,10, cellular fysiologi11,12, økologi og energi13 ,14,15,16,17, atferd18,19, og makroevolusjon3,20,21 .
Mer nylig har det vært en spredning av genomisk, transcriptomic, og Proteomikk ressurser for elektrisk fisk1,22,23,24,25,26, 27,28. Bruk av disse ressursene har allerede produsert viktig innsikt om sammenhengen mellom genotype og fenotype i disse artene1,2,3,28,29 ,30. Et stort hinder for å integrere Genomics data med fenotypiske data av svakt elektrisk fisk er en gave mangel på funksjonelle Genomics verktøy31.
Et slikt verktøy er den nylig utviklet gruppert regelmessig oppdelt Short Palindromic gjentar sammenkoblet med Cas9 endonuclease (CRISPR/Cas9, CRISPR) teknikk. CRISPR/Cas9 er en Genova redigere bort verktøyet det har inngikk utstrakt bruk inne begge to modell32,33,34 og ingen-modell organisere35,36,37 ens. CRISPR/Cas9 teknologi har kommet til et punkt der et laboratorium i stand til grunnleggende molekylærbiologi kan lett generere gen-spesifikke sonder kalt kort guide RNAs (sgRNAs), til en lav kostnad ved hjelp av en ikke-kloning metode38. CRISPR har fordeler fremfor andre knockout/knockdown strategier, slik som morpholinos39,40, transkripsjon aktivator-lignende effektor nukleaser (TALENs), og sink finger nukleaser (zfner), som er kostbare og tidkrevende å generere for hvert mål genet.
Den CRISPR/Cas9 System funksjoner for å skape genet Knockouts ved å målrette en bestemt region av Genova, regissert av sgRNA sekvensen, og forårsaker en dobbel-strandet pause. Den doble strandet pause oppdages av cellen og utløser endogene DNA reparasjon mekanismer fortrinnsvis bruker ikke-homologe slutten sammenføyning (NHEJ) veien. Denne veien er svært feil utsatt: under reparasjonsprosessen, DNA-molekylet vil ofte innlemme innsettinger eller slettinger (indeler) på dobbel-strandet pause området. Disse indeler kan føre til tap av funksjon på grunn av enten (1) Skift i den åpne lese RAM men, (2) innsetting av en for tidlig stopp-Codon, eller (3) endringer i den kritiske primære strukturen av genet produktet. I denne protokollen, bruker vi CRISPR/Cas9 redigering til målet punkt mutasjoner i målet gener ved hjelp av NHEJ i svakt elektriske fiskearter. Mens enklere og mer effektiv enn andre teknikker, er denne metoden for mutagenese forventes å resultere i en rekke fenotypiske alvorlighetsgradene i F0, som er tilskrevet genetisk mosaikk41,42,43 ,44.
Utvalg av organismer
For å tilrettelegge fremtidige studier på komparativ Genomics av svakt elektrisk fisk, en representativ arter for både gymnotiforms og mormyrids for protokoll utvikling nødvendig for å bli valgt. Etter diskusjoner i løpet av 2016 Electric Fish møte i Montevideo, Uruguay, det var samfunnet konsensus for å utnytte arter som allerede kan bli avlet i laboratoriet og som hadde genomisk ressurser tilgjengelig. Den gymnotiform Brachyhypopomus gauderio og mormyrid Brienomyrus brachyistius ble valgt som arter som passer disse kriteriene. I begge artene er naturlige indikatorer for å indusere og opprettholde avl forhold lett å etterligne i fangenskap. B. gauderio, en gymnotiform Art fra Sør-Amerika, har fordelen av krav til lav husdyrhold: fisk kan oppbevares ved relativt høy tetthet i relativt små (4 L) tanker. B. gauderio har også rask generasjonsskifte omsetning under forhold med fange. Under laboratorieforhold, kan B. gauderio utvikle seg fra egg til voksen i ca 4 måneder.
B. brachyistius, en art av mormyrid fisk fra Vest-Sentral-Afrika, raser lett i fangenskap. B. brachyistius er lett tilgjengelig gjennom akvariet handelen, har vært mye brukt i mange studier, og har nå en rekke genomisk ressurser tilgjengelig. Deres livssyklus spenner over 1 − 3 år, avhengig av laboratorieforhold. Kravene til reindrift er noe mer intensive for denne arten, som krever moderat store tanker (50 − 100 L) på grunn av aggresjon under avl.
Laboratorier som studerer andre arter av elektrisk fisk skal kunne enkelt tilpasse denne protokollen så lenge arten kan være avlet, og enkelt celle embryo kan samles og oppvokst i voksen alder. Boliger, larvestadiet husdyrhold, og in vitro befruktning (IVF) priser vil trolig endres med andre arter; Imidlertid kan denne protokollen brukes som et utgangspunkt for avl forsøk i andre svakt elektrisk fisk.
En ideal Gene mål for Proof av begrep: scn4aa
Svakt elektrisk mormyrid og gymnotiform fisk genererer elektriske felt (electrogenesis) ved å tømme en spesialisert organ, kalt elektrisk organ. Elektriske orgel utslipp (EODs) er et resultat av samtidig produksjon av handlings potensialer i de elektriske organ cellene som kalles electrocytes. EODs oppdages av en rekke elektroreseptorer i huden for å lage høyoppløselige elektriske bilder av Fiskene omgivelser45. Svakt elektrisk fisk er også i stand til å oppdage funksjoner i deres conspecifics ‘ EOD bølgeformer18 så vel som deres utslipp priser46, slik at EODs å fungere i tillegg som en sosial kommunikasjon signal analoge til fuglesang eller frosk vocalizations47.
En hovedkomponent i aksjon potensiell generasjon i electrocytes av både mormyrid og gymnotiform svakt elektrisk fisk er spenning-gated natrium kanal NaV 1.42. Ikke-elektriske teleosts uttrykker to paralogous gen kopier, scn4aa og scn4ab, koding for spennings-gated natrium kanal NAV 1.430. I både gymnotiform og mormyrid svakt elektrisk fisk linjene, scn4aa har utviklet seg raskt og gjennomgått mange aminosyre erstatninger som påvirker dens kinetisk egenskaper48. Viktigst, scn4aa har blitt compartmentalized i begge linjene til elektrisk organ2,3. Den relativt begrensede uttrykk for scn4aa til elektrisk organ, så vel som sin nøkkelrolle i generasjonen av EODs, gjør det til et ideelt mål for CRISPR/Cas9 knockout eksperimenter, som det har minimal skadelige pleiotropic effekter. Fordi svakt elektrisk fisk begynner å tømme sine larvestadiet elektriske organer 6 − 8 dager etter befruktning (DPF), er målretting av scn4aa ideell for rask bestemmelse av fenotype etter embryo microinjection.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den fenotypiske rikdommen av svakt elektrisk fisk, sammen med en fersk spredning av Genomics ressurser, motiverer et sterkt behov for funksjonelle genomisk verktøy i svakt elektrisk fisk modell. Dette systemet er spesielt attraktivt på grunn av den konvergent utviklingen av mange fenotypiske trekk i parallelle linjene av fisk, som er lett oppbevares i laboratoriet.
Protokollen som beskrives her demonstrerer effekten av CRISPR/Cas9 teknikk i linjene av svakt elektrisk fisk som utviklet seg el…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne erkjenner den heroiske innsatsen til Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud, og Hope Healey for hjelp med fiskeoppdrett, datainnsamling, og tidlig protokoll utvikling. Vi vil også gjerne takke de tre anmeldere for deres forslag til manuskriptet. Vi tror det endelige produktet til å være av bedre kvalitet etter adressering sine kommentarer. Dette arbeidet ble finansiert av støtte fra National Science Foundation #1644965 og #1455405 til JRG, og naturvitenskap og engineering Research Council DG stipend til VLS.
Materials
| 20 mg/mL RNA grade Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
| 50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
| borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length) |
| Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
| Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | 10289651 | |
| Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14-824-654 | referred to as "precision glass syringe" in the protocol |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | referred to as "delicate task wipe" in the protocol |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| NEBuffer 3 | NEB | B7003S | used for in vitro cleavage assay |
| OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
| Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | referred to as "spawning agent" in the protocol |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | referred to as "thermoplastic" in the protocol |
| Pipette puller | WPI | SU-P97 | sutter brand |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Reusable needle- requires customization | Fisher Scientific | 7803-02 | Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25 |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | Use with the 10X NEB buffer that is included |
| Teflon coated tools | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol |
References
- Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344 (6191), 1522-1525 (2014).
- Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M. Sodium channel genes and the evolution of diversity in communication signals of electric fishes: convergent molecular evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (10), 3675-3680 (2006).
- Arnegard, M. E., Zwickl, D. J., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system–twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22172-22177 (2010).
- Lissmann, H. W. Continuous electrical signals from the tail of a fish. Gymnarchus niloticus Cuv. Nature. 167 (4240), 201-202 (1951).
- Cuellar, H., Kim, J. A., Unguez, G. A. Evidence of post-transcriptional regulation in the maintenance of a partial muscle phenotype by electrogenic cells of S. macrurus. FASEB Journal. 20 (14), 2540 (2006).
- Modrell, M. S., Baker, C. V. Evolution of electrosensory ampullary organs: conservation of Eya4 expression during lateral line development in jawed vertebrates. Evolution & Development. 14 (3), 277-285 (2012).
- Hopkins, C. D. Design features for electric communication. Journal of Experimental Biology. 202, 1217-1228 (1999).
- Kawasaki, M. Sensory hyperacuity in the jamming avoidance response of weakly electric fish. Current Opinion in Neurobiology. 7 (4), 473-479 (1997).
- Bell, C. C., Han, V. Z., Sugawara, Y., Grant, K. Synaptic plasticity in a cerebellum-like structure depends on temporal order. Nature. 387 (6630), 278-281 (1997).
- Heiligenberg, W. . Neural Nets in Electric Fish. , (1991).
- Ban, Y., Smith, B. E., Markham, M. R. A highly polarized excitable cell separates sodium channels from sodium-activated potassium channels by more than a millimeter. Journal of Neurophysiology. 114 (1), 520-530 (2015).
- Markham, M. R., Kaczmarek, L. K., Zakon, H. H. A sodium-activated potassium channel supports high-frequency firing and reduces energetic costs during rapid modulations of action potential amplitude. Journal of Neurophysiology. 109 (7), 1713-1723 (2013).
- Gavassa, S., Stoddard, P. K. Food restriction promotes signaling effort in response to social challenge in a short-lived electric fish. Hormones and Behavior. 62 (4), 381-388 (2012).
- Sinnett, P. M., Markham, M. R. Food deprivation reduces and leptin increases the amplitude of an active sensory and communication signal in a weakly electric fish. Hormones and Behavior. 71, 31-40 (2015).
- Salazar, V. L., Stoddard, P. K. Sex differences in energetic costs explain sexual dimorphism in the circadian rhythm modulation of the electrocommunication signal of the gymnotiform fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Journal of Experimental Biology. 211, 1012-1020 (2008).
- Lewis, J. E., Gilmour, K. M., Moorhead, M. J., Perry, S. F., Markham, M. R. Action potential energetics at the organismal level reveal a trade-off in efficiency at high firing rates. Journal of Neuroscience. 34 (1), 197-201 (2014).
- Salazar, V. L., Krahe, R., Lewis, J. E. The energetics of electric organ discharge generation in gymnotiform weakly electric fish. Journal of Experimental Biology. 216 (13), 2459-2468 (2013).
- Hopkins, C. D., Bass, A. Temporal coding of species recognition signals in an electric fish. Science. 212 (4490), 85-87 (1981).
- Arnegard, M. E., Jackson, B. S., Hopkins, C. D. Time-domain signal divergence and discrimination without receptor modification in sympatric morphs of electric fishes. The Journal of Experimental Biology. 209, 2182-2198 (2006).
- Sullivan, J. P., Lavoue, S., Arnegard, M. E., Hopkins, C. D. AFLPs resolve phylogeny and reveal mitochondrial introgression within a species flock of African electric fish (Mormyroidea: Teleostei). Evolution. 58 (4), 825-841 (2004).
- Crampton, W. G. R. Effects of anoxia on the distribution, respiratory strategies and electric signal diversity of gymnotiform fishes. Journal of Fish Biology. 53, 307-330 (1998).
- Pinch, M., Guth, R., Samanta, M. P., Chaidez, A., Unguez, G. A. The myogenic electric organ of Sternopygus macrurus: a non-contractile tissue with a skeletal muscle transcriptome. PeerJ. 4, 1828 (2016).
- Lamanna, F., Kirschbaum, F., Waurick, I., Dieterich, C., Tiedemann, R. Cross-tissue and cross-species analysis of gene expression in skeletal muscle and electric organ of African weakly-electric fish (Teleostei; Mormyridae). BMC Genomics. 16, 668 (2015).
- Traeger, L. L., et al. Unique patterns of transcript and miRNA expression in the South American strong voltage electric eel (Electrophorus electricus). BMC Genomics. 16, 243 (2015).
- Salisbury, J. P., et al. The central nervous system transcriptome of the weakly electric brown ghost knifefish (Apteronotus leptorhynchus): de novo assembly, annotation, and proteomics validation. BMC Genomics. 16, 166 (2015).
- Lamanna, F., Kirschbaum, F., Tiedemann, R. De novo assembly and characterization of the skeletal muscle and electric organ transcriptomes of the African weakly electric fish Campylomormyrus compressirostris (Mormyridae, Teleostei). Molecular Ecology Resources. 14 (6), 1222-1230 (2014).
- Mate, S. E., Brown, K. J., Hoffman, E. P. Integrated genomics and proteomics of the Torpedo californica electric organ: concordance with the mammalian neuromuscular junction. Skeletal Muscle. 1 (1), 20 (2011).
- Swapna, I., et al. Electrostatic Tuning of a Potassium Channel in Electric Fish. bioRxiv. , (2017).
- Futuyma, . Evolution. Third Edition. , (2013).
- Thompson, A., Vo, D., Comfort, C., Zakon, H. H. Expression Evolution Facilitated the Convergent Neofunctionalization of a Sodium Channel Gene. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 1941-1955 (2014).
- Pitchers, W. R., Constantinou, S. J., Losilla, M., Gallant, J. R. Electric fish genomics: Progress, prospects, and new tools for neuroethology. Journal of Physiology Paris. , (2016).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Jung, C. J., et al. Efficient gene targeting in mouse zygotes mediated by CRISPR/Cas9-protein. Transgenic Research. 26 (2), 263-277 (2017).
- Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR Toolbox in Zebrafish for Studying Development and Disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (13), (2019).
- Zu, Y., et al. Biallelic editing of a lamprey genome using the CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 6, 23496 (2016).
- Crispo, M., et al. Efficient Generation of Myostatin Knock-Out Sheep Using CRISPR/Cas9 Technology and Microinjection into Zygotes. PLoS One. 10 (8), 0136690 (2015).
- Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and Prospects of CRISPR/Cas Systems in Insects and Other Arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
- Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), 98186 (2014).
- Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. 32 (1), 97-108 (2015).
- Morcos, P. A., Vincent, A. C., Moulton, J. D. Gene Editing Versus Morphants. Zebrafish. 12 (5), 319 (2015).
- Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
- Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Developmental Biology. 393 (1), 3-9 (2014).
- Singh, P., Schimenti, J. C., Bolcun-Filas, E. A Mouse Geneticist’s Practical Guide to CRISPR Applications. Genetics. 199 (1), 1-15 (2015).
- Mianné, J., et al. Analyzing the outcome of CRISPR-aided genome editing in embryos: screening, genotyping and quality control. Methods. 121-122, 68-76 (2017).
- van der Emde, G., Breed, M. D., Moore, J. . Encyclopedia of Animal Behavior. 1, 16-23 (2010).
- Carlson, B. A., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U., Hirsch, M. C. . Encyclopedia of Neuroscience. , 4039-4044 (2009).
- Hopkins, C. D. Neruoethology of Electric Communication. Annual Reviews of Neuroscience. 11, 497-535 (1988).
- Arnegard, M., Zwickl, D., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system- twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22172-22177 (2010).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Resarch. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Kirschbaum, F. Environmental factors control the periodical reproduction of tropical electric fish. Experientia. 31 (10), 1159-1160 (1975).
- Iwama, G. K., McGeer, J. C., Pawluk, M. P. The effects of five fish anaesthetics on acid-base balance, hematocrit, cortisol and adrenaline in rainbow trout. Canadian Journal of Zoology. 67, 2065-2073 (1989).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed. , (2000).
- Barrangou, R., Doudna, J. A. Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Nature Biotechnology. 34 (9), 933-941 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Maruyama, T., et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nature Biotechnology. 33 (5), 538-542 (2015).
- Liu, M., et al. Methodologies for Improving HDR Efficiency. Frontiers in Genetics. 9, 691 (2018).
- Kirschbaum, F., et al. Intragenus (Campylomormyrus) and intergenus hybrids in mormyrid fish: Physiological and histological investigations of the electric organ ontogeny. Journal of Physiology Paris. 110, 281-301 (2016).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
