Миграция, химиотерапия, и совместно-культурные анализы для стволовых клеток человека, полученных эндотелиальных клеток и ГАМК нейронов
Summary
Мы представляем три простых in vitro-анализы миграции на расстоянии, анализ миграции совместной культуры и анализ химиотерапии-притяжения, которые коллективно оценивают функции стволовых клеток человека, полученных перивентрикулярных эндотелиальных клеток и их взаимодействия с ГАМК-интернейронов.
Abstract
Роль сосудистой системы головного мозга в развитии нервной системы и этиологии нарушений головного мозга все больше привлекает внимание. Наши недавние исследования выявили особую популяцию сосудистых клеток, перивентрикулярных эндотелиальных клеток, которые играют важную роль в миграции и распределении передних ГАМК-интернейронов во время эмбрионального развития. Это, в сочетании с их клеточной автономной функции, намекает на новые роли перивентрикулярных эндотелиальных клеток в патологии нейропсихиатрических расстройств, как шизофрения, эпилепсия, и аутизм. Здесь мы описали три различных in vitro анализы, которые коллективно оценить функции перивентрикулярных эндотелиальных клеток и их взаимодействие с ГАМК-интернейронов. Использование этих анализов, особенно в человеческом контексте, позволит нам определить связь между перивентрикулярными эндотелиальными клетками и нарушениями мозга. Эти анализы являются простыми, низкой стоимости, и воспроизводимые, и могут быть легко адаптированы к любому типу адепта клеток.
Introduction
Эндотелиальные клетки образуют слизистую оболочку кровеносных сосудов и посредничают в важных функциях, которые включают поддержание проницаемости стенки сосудов, регуляцию кровотока, агрегацию тромбоцитов и образование новых кровеносных сосудов. В головном мозге эндотелиальные клетки являются частью критического гематоэнцефалического барьера, который жестко контролирует обмен материалами между мозгом и кровотоком1. Наши исследования в последнее десятилетие определили новые нейрогенные роли эндотелиальных клеток мозга, которые имеют значительные последствия для развития мозга и поведения2,3,4,5. Мы показали, что мышь эмбрионального переднего мозга васкуляризовано двумя различными подтипами сосудов, pial сосудов и перивентрикулярных сосудов, которые отличаются по анатомии, происхождению и развития профиля2. Эндотелиальные клетки, выстилающие эти два подтипа сосуда, показывают явные различия в профилях экспрессии генов. В то время как pial эндотелиальные клетки в основном выражают гены, связанные с воспалением и иммунным ответом, перивентрикулярные эндотелиальные клетки однозначно обогащены экспрессией генов, обычно связанных с нейрогенезом, нейрональной миграцией, хемотаксисом и аксоном3. Перивентрикулярные эндотелиальные клетки также дом роман ГАМК сигнальный путь, который отличается от традиционных нейрональных ГАМК сигнализации пути5. Сопутствуя экспрессии гена, перивентрикулярные эндотелиальные клетки были найдены для регулирования миграции и распределения ГАМК-интернейронов в развивающихся неокортекс. Во время эмбрионального развития, перивентрикулярные эндотелиальные клетки проходят междугородную миграцию вдоль брюшно-дорсального градиента для установления перивентрикулярной сосудистой сети2,3. Этот миграционный маршрут отражается на следующий день interneurons. Мигрирующие интернейроны физически взаимодействуют с заранее сформированной перивентрикулярной сосудистой сетью и используют ее в качестве путеводителя для достижения конечного пункта назначения в неокортексе. В дополнение к действуя в качестве физического субстрата, перивентрикулярные эндотелиальные клетки служат источником навигационных сигналов для мигрирующих нейронов. Перивентрикулярный эндотелиальной клеточной секретной ГАМК направляет интернерон миграции и регулирует их окончательное распределение моделей4. Дефекты в интернеронной миграции и распределении связаны с нейропсихиатрическими расстройствами, такими как аутизм, эпилепсия, шизофрения и депрессия6,7,8,9,10. Таким образом, изучение перивентрикулярных эндотелиальных клеточных функций и их влияние на межжелудочковую миграцию в человеческом контексте становится критическиважным для решения патогенеза этих расстройств.
Мы создали человека перивентрикулярных, как эндотелиальные клетки из человеческих эмбриональных стволовых клеток в нашей лаборатории11, используя индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) технология12,13. Чтобы проверить, имитируют ли человеческие перивентрикулярные эндотелиальные клетки, верно имитируют мышиные перивентрикулярные эндотелиальные клетки, и количественно оценить их влияние на миграцию интернеров, мы разработали три анализы in vitro: анализ миграции на расстоянии, анализ миграции между культурой и анализ хемо-притяжения. Здесь мы подробно описываем протоколы этих анализов. Все три анализы основаны на использовании силиконовой культуры вставки для создания небольшой прямоугольный участок клеток (фиксированных размеров) в окружении клеточного пространства. Расстояние миграции оценивается путем измерения расстояния между конечными позициями ячеек от границы прямоугольного пятна, которое было изложено в день 0. В ходе дальнего анализа миграции человеческие перивентрикулярные эндотелиальные клетки засеиваются в виде пластыря в центре 35-мм тарелки, и рассчитываются расстояния, пройденные клетками в течение длительного времени. В исследовании миграции сокультуры, человеческие перивентрикулярные эндотелиальные клетки со-сеяные с человеческими интернейронами, как один патч в 35-мм блюдо. Эта установка позволяет изучить влияние прямых физических взаимодействий этих двух типов клеток на скорость миграции интернейронов. Химио-притяжения асссеизмерия измеряет миграцию интернейронов в ответ на химио-привлекательные сигналы, выделяемые перивентрикулярными эндотелиальными клетками человека. Interneurons посеяны как прямоугольный патч, с человека перивентрикулярных эндотелиальных клеток и контроля не-перивентрикулярных эндотелиальных клеток, посеянных как аналогичные размеры патчи с обеих сторон. Каждый из ячеек патчи разделены клеточной свободной разрыв 500 мкм. Реакция межнейронов оценивается путем количественной оценки числа клеток, которые мигрировали в перивентрикулярных эндотелиальных клеток по сравнению с контролем неперивентрикулярных эндотелиальных клеток.
Эти анализы обеспечивают надежную оценку человеческих перивентрикулярных эндотелиальных клеточных функций и их влияния на интернеронную миграцию. Новая установка дальнего анализа и совместной культуры миграции анализ обеспечивает ячейки свободного пространства в диапазоне сантиметров (1-1,5 см), чтобы позволить обнаружение междугородной миграции. Краткое изложение особенностей наших анализов по сравнению с другими популярными анализами представлено в таблице 1. В совокупности, анализы, описанные здесь будет служить в качестве платформы для оценки “болезненных” перивентрикулярных эндотелиальных клеток и интернейронов, порожденных iPSCs расстройств головного мозга, как шизофрения, аутизм или эпилепсия. Эти анализы также могут быть использованы для определения того, как различные условия (например, ингибиторы, лиганды, РНК) влияют на миграцию клеток. Наконец, эти анализы могут быть оптимизированы для других типов клеток для измерения междугородной миграции, химиотерапии-притяжения или опосредоченной миграции клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описали три in vitro анализы, которые вместе обеспечивают количественную оценку человека перивентрикулярных эндотелиальных клеточных свойств. Эти анализы будут полезны в получении механистических понимание взаимодействия человека перивентрикулярных эндотелиальных клеток с ч…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана наградами От Национального института психического здоровья (R01MH10438) и Национального института неврологических расстройств и инсульта (R01NS100808) а.В.
Materials
| Accutase dissociation solution | Millipore Sigma | SCR005 | Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4) |
| Anti-human β-Tubulin antibody | Biolegend | 802001 | |
| Anti-human CD31 antibody | Millipore Sigma | CBL468 | |
| Anti- MAP2 antibody | Neuromics | CH22103 | |
| Anti-active Caspase 3 antibody | Millipore Sigma | AB3623 | |
| Control human endothelial cells | Cellular Dynamics | R1022 | |
| Control endothelial Cells Medium Supplement | Cellular Dynamics | M1019 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 03-337-7Y | |
| DMEMF/12 medium | Thermofisher Scientific | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| E6 medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
| FGF2 | Thermofisher Scientific | PHG0261 | |
| Fibronectin | Thermofisher Scientific | 33016-015 | |
| Freezing Container | Thermofisher Scientific | 5100 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Human GABAergic neurons | Cellular Dynamics | R1013 | |
| Human GABAergic neurons base medium | Cellular Dynamics | M1010 | |
| Human GABAergic neuron Neural supplement | Cellular Dynamics | M1032 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
| Mounting Medium | Vector laboratories | H-1200 | |
| poly-L-ornithin | Sigma | p4957 | |
| PBS | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| Trypan blue | Thermofisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE | Thermofisher Scientific | 12563011 | Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4) |
| VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | Lifeline Cell Technologies | LL-0003 | Component of control human endothelial cell medium |
| 2-well silicone culture-Insert | ibidi | 80209 | |
| 3-well silicone culture-Insert | ibidi | 80369 | |
| 35 mm dish | Corning | 430165 | |
| 15-ml conical tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 4% PFA solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| Inverted phase contrast microscope | Zeiss | Zeiss Axiovert 40C | |
| Fluorescent microscope | Olympus | FSX-100 |
References
- Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).
- Won, C., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nature Communications. 4, 2149 (2013).
- Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture. The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).
- Li, S., et al. Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior. Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).
- Lewis, D. A., Levitt, P. Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment. Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).
- Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. Cortical inhibitory neurons and schizophrenia. Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).
- Marin, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders. Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).
- Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42 (3), 8-12 (2001).
- Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders. Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , (2018).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient?. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).
- Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).
- Vissapragada, R., et al. Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit. Brain Research. 1565, 8-17 (2014).
- JoVE Science Education Database. Cell Biology. The Transwell Migration Assay. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Renaud, J., Martinovic, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. 113, e54356 (2016).
- Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber. Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).
- Kim, B. J., Wu, M. Microfluidics for mammalian cell chemotaxis. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).
