الهجرة، والجذب الكيميائي، ومقالات الثقافة المشتركة للخلايا الأنبوسلية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية والخلايا العصبية GABAergic
Summary
نقدم ثلاثة بسيط في المختبر ومقالات الهجرة لمسافات طويلة ، والدراسة المشتركة للهجرة الثقافة ، والكيميائية جاذبية الجاذبية والمواد التي تقيم بشكل جماعي وظائف الخلايا الجذعية البشرية المستمدة الخلايا البطانية التشعبية ولهم التفاعل مع الخلايا العصبية المشتركة GABAergic.
Abstract
دور الأوعية الدموية في الدماغ في تطوير الجهاز العصبي ومسببات اضطرابات الدماغ تكتسب اهتماما متزايدا. وقد حددت دراساتنا الحديثة مجموعة خاصة من الخلايا الوعائية، والخلايا الفيوذيلية التشعبية، التي تلعب دورا حاسما في هجرة وتوزيع الخلايا العصبية المشتركة GABAergic prebrain أثناء التطور الجنيني. هذا، إلى جانب وظائفها المستقلة الخلية، يلمح إلى أدوار جديدة من الخلايا الفيوذيلية التشعبية التشعبية في علم الأمراض من الاضطرابات العصبية النفسية مثل الفصام، والصرع، والتوحد. هنا، وصفنا ثلاثة مقالات مختلفة في المختبر التي تقيّم بشكل جماعي وظائف الخلايا البطانية التشعبية التشعبية وتفاعلها مع الخلايا العصبية البينية GABAergic. استخدام هذه المقالات، لا سيما في سياق الإنسان، سوف تسمح لنا لتحديد الصلة بين الخلايا التناسلية التشعبية المعطبية واضطرابات الدماغ. هذه المقالات بسيطة ومنخفضة التكلفة وقابلة للاستنساخ ، ويمكن تكييفها بسهولة مع أي نوع خلية ملتصقة.
Introduction
الخلايا البطانة تشكل بطانة الأوعية الدموية وتتوسط وظائف هامة التي تشمل الحفاظ على نفاذية جدار السفينة, تنظيم تدفق الدم, تجميع الصفائح الدموية, وتشكيل الأوعية الدموية الجديدة. في الدماغ، تشكل الخلايا الفيوذيلية جزءا من حاجز الدم الدماغ الحرجة التي تسيطر بإحكام تبادل المواد بين الدماغ ومجرى الدم1. وقد حددت دراساتنا في العقد الماضي الأدوار العصبية الجديدة للخلايا البُنائية للدماغ التي لها آثار كبيرة على نمو الدماغ وسلوكه2،3،4،5. لقد أظهرنا أن الدماغ الأمامي الجنيني للفأر هو الأوعية الدموية من قبل نوعين فرعيين متميزين من الأوعية، والأوعية البيال والأوعية المحيطية، التي تختلف في التشريح والأصل، والشخصية التنموية2. الخلايا البطانة بطانة هذين النوعين الفرعيين السفينة تظهر اختلافات واضحة في ملامح التعبير الجيني. في حين أن الخلايا اللبية اللبية اللبية تعبر في الغالب عن الجينات المتعلقة بالالتهاب والاستجابة المناعية ، فإن الخلايا اللبية اللبية يتم تخصيبها بشكل فريد في التعبير عن الجينات المرتبطة عادة بالتكوين العصبي ، والهجرة العصبية ، chemotaxis ، والتوجيه المحوري3. الخلايا البُصيّدة التبذيلية التعامدية أيضاً بيت رواية GABA إشارة مسار التي تتميز عن الخلايا العصبية التقليدية GABA إشارة المسار5. بالتزامن مع التعبير الجيني، تم العثور على الخلايا الفيوذيلية التشعبية لتنظيم الهجرة وتوزيع الخلايا العصبية المشتركة GABAergic في القشرة الجديدة النامية. أثناء التطور الجنيني ، تخضع الخلايا الفيوثيريلية العمودية للهجرة لمسافات طويلة على طول تدرج الصمام البطني لإنشاء شبكة الأوعية الدموية العمودية2،3. وينعكس هذا الطريق الهجرة بعد يوم واحد من قبل interneurons. المهاجرة interneurons تتفاعل جسديا مع شبكة الأوعية الدموية عمودي شكلت مسبقا واستخدامها كدليل للوصول إلى وجهتها النهائية في القشرة الجديدة. بالإضافة إلى العمل كركيزة مادية، تعمل الخلايا العضوية العضوية العضوية العضوية العضوية كمصدر للإشارات الملاحية للخلايا العصبية المهاجرة. الخلايا التشعبية التشعبية التشعب GABA أدلة الهجرة interneuron وينظم أنماط التوزيع النهائي4. ترتبط العيوب في هجرة الخلايا العصبية البينية وتوزيعها بالاضطرابات العصبية النفسية مثل التوحد والصرع والفصام والاكتئاب6و7و8و9و10. لذلك ، تصبح دراسة وظائف الخلايا الفيوذيلية المعطبة وتأثيرها على هجرة الخلايا العصبية البينية في السياق البشري أمرًا حاسمًا لمعالجة الإمراض لهذه الاضطرابات.
لقد قمنا بتوليد الخلايا البُطاجنة الشبيهة بالمفصلية البشرية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في مختبرنا11، باستخدام تكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC)12،13. للتحقق مما إذا كانت الخلايا البطانية التعشية ية البشرية تحاكي بأمانة الخلايا البطانية التعشيةية للفأرة، ولتقييم تأثيرها على هجرة الخلايا العصبية البينية تقييمًا كمًا، قمنا بتطوير ثلاث تقييمات في المختبر: فحص هجرة لمسافات طويلة، ودراسة هجرة مشتركة في الثقافة، وفحص كيميائي جذاب. هنا نصف بروتوكولات هذه المقالات بالتفصيل. وتستند جميع المقالات الثلاث على استخدام إدراج ثقافة السيليكون لإنشاء رقعة مستطيلة صغيرة من الخلايا (ذات الأبعاد الثابتة) محاطة بمساحة خالية من الخلايا. يتم تقييم مسافة الترحيل عن طريق قياس المسافة بين المواضع النهائية للخلايا من حدود الرقعة المستطيلة التي تم تحديدها في اليوم 0. في اختبار الهجرة لمسافات طويلة ، يتم بذر الخلايا البُطاية التشعبية المعفرة البشرية كرقعة في وسط طبق 35 ملم ، ويتم حساب المسافات التي تقطعها الخلايا على مدى طويل من الزمن. في تحليل الهجرة في الثقافة المشتركة، تشارك الخلايا الفيوذيلية التعبدية البشرية مع الخلايا العصبية البشرية كرقعة واحدة في طبق 35 ملم. هذا الإعداد يسمح بفحص تأثير التفاعلات المادية المباشرة من هذين النوعين من الخلايا على معدل الهجرة من interneurons. يقيس إجراء الجاذبية الكيميائية هجرة الخلايا العصبية البينية استجابة للإشارات الجذابة كيميائيًا التي تفرزها الخلايا الفيوذيلية المحيطية البشرية. يتم بذر الخلايا العصبية البينية كرقعة مستطيلة ، مع خلايا البوذيلية التعشية ية التعشية ية البشرية والتحكم في الخلايا البُنائية غير التعشيةية غير المعبّرة كبقع مماثلة الحجم على كلا الجانبين. يتم فصل كل من بقع الخلية بواسطة فجوة خالية من الخلايا من 500 ميكرومتر. يتم تقييم استجابة الخلايا العصبية البينية عن طريق تحديد عدد الخلايا التي هاجرت نحو الخلايا البُضائية التشعبية التشعبية التشعبية التشعبية بالقياس إلى التحكم في الخلايا البُنْمية غير التضائية التضائية غير التضافرية.
توفر هذه المقالات تقييمًا قويًا لوظائف الخلايا البُلية التعشيةية البشرية وتأثيرها على هجرة الخلايا العصبية البينية. يوفر الإعداد الجديد للاقاعات طويلة المدى وزراعة المشاركة في نقل الثقافة مساحة خالية من الخلايا في نطاق سنتيمتر (~ 1-1.5 سم) للسماح بالكشف عن الهجرة لمسافات طويلة. ويرد في الجدول 1ملخص لملامح مقالاتنا مقارنة بمقالاتنا الشائعة الأخرى. بشكل جماعي ، فإن المقالات الموصوفة هنا ستكون بمثابة منصة لتقييم الخلايا الفيوليلية “المريضة” والخلايا العصبية البينية الناتجة عن iPSCs من اضطرابات الدماغ مثل الفصام أو التوحد أو الصرع. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه المقالات لتحديد كيفية الظروف المختلفة (مثل مثبطات، ليغاند، RNAi) تؤثر على هجرة الخلايا. وأخيراً، يمكن تحسين هذه المقالات لأنواع الخلايا الأخرى لقياس الهجرة لمسافات طويلة، أو الجاذبية الكيميائية، أو الهجرة بوساطة الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، وصفنا ثلاثة في المختبر ومقالات التي توفر معا التقييم الكمي للخصائص البطانية الانجيلية الكلية البشرية. هذه التحليلات ستكون ذات قيمة في اكتساب رؤى ميكانيكية في تفاعل الخلايا الفيوثيلية التشعبية التبصرية البشرية مع الخلايا العصبية البشرية. التجارب باستخدام ligands، مثبطات، أو الخلايا م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال جوائز من المعهد الوطني للصحة العقلية (R01MH110438) والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (R01NS100808) إلى AV.
Materials
| Accutase dissociation solution | Millipore Sigma | SCR005 | Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4) |
| Anti-human β-Tubulin antibody | Biolegend | 802001 | |
| Anti-human CD31 antibody | Millipore Sigma | CBL468 | |
| Anti- MAP2 antibody | Neuromics | CH22103 | |
| Anti-active Caspase 3 antibody | Millipore Sigma | AB3623 | |
| Control human endothelial cells | Cellular Dynamics | R1022 | |
| Control endothelial Cells Medium Supplement | Cellular Dynamics | M1019 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 03-337-7Y | |
| DMEMF/12 medium | Thermofisher Scientific | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| E6 medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
| FGF2 | Thermofisher Scientific | PHG0261 | |
| Fibronectin | Thermofisher Scientific | 33016-015 | |
| Freezing Container | Thermofisher Scientific | 5100 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Human GABAergic neurons | Cellular Dynamics | R1013 | |
| Human GABAergic neurons base medium | Cellular Dynamics | M1010 | |
| Human GABAergic neuron Neural supplement | Cellular Dynamics | M1032 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
| Mounting Medium | Vector laboratories | H-1200 | |
| poly-L-ornithin | Sigma | p4957 | |
| PBS | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| Trypan blue | Thermofisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE | Thermofisher Scientific | 12563011 | Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4) |
| VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | Lifeline Cell Technologies | LL-0003 | Component of control human endothelial cell medium |
| 2-well silicone culture-Insert | ibidi | 80209 | |
| 3-well silicone culture-Insert | ibidi | 80369 | |
| 35 mm dish | Corning | 430165 | |
| 15-ml conical tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 4% PFA solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| Inverted phase contrast microscope | Zeiss | Zeiss Axiovert 40C | |
| Fluorescent microscope | Olympus | FSX-100 |
References
- Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).
- Won, C., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nature Communications. 4, 2149 (2013).
- Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture. The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).
- Li, S., et al. Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior. Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).
- Lewis, D. A., Levitt, P. Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment. Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).
- Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. Cortical inhibitory neurons and schizophrenia. Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).
- Marin, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders. Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).
- Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42 (3), 8-12 (2001).
- Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders. Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , (2018).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient?. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).
- Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).
- Vissapragada, R., et al. Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit. Brain Research. 1565, 8-17 (2014).
- JoVE Science Education Database. Cell Biology. The Transwell Migration Assay. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Renaud, J., Martinovic, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. 113, e54356 (2016).
- Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber. Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).
- Kim, B. J., Wu, M. Microfluidics for mammalian cell chemotaxis. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).
