Migração, Quimio-Atração e Ensaios de Cocultura para Células Endoteliais derivadas de células-tronco humanas e neurônios gabaergicos

Summary

Apresentamos três simples ensaios in vitro – o ensaio migratório de longa distância, o ensaio de migração de cocultura, e o ensaio de atração de quimioterapia – que avaliam coletivamente as funções das células-tronco humanas derivadas células endoteliais periventriculares e suas interação com interneurônios GABAergic.

Abstract

O papel da vasculatura cerebral no desenvolvimento do sistema nervoso e na etiquetação de distúrbios cerebrais está ganhando cada vez mais atenção. Nossos estudos recentes identificaram uma população especial de células vasculares, as células endoteliais periventriculares, que desempenham um papel crítico na migração e distribuição de interneurônios gabaergicos do cérebro anterior durante o desenvolvimento embrionário. Isso, juntamente com suas funções autônomas de células, alude a novos papéis de células endoteliais periventriculares na patologia de doenças neuropsiquiátricas como esquizofrenia, epilepsia e autismo. Aqui, descrevemos três ensaios in vitro diferentes que avaliam coletivamente as funções das células endoteliais periventriculares e sua interação com interneurônios gabaergicos. O uso desses ensaios, particularmente em um contexto humano, nos permitirá identificar a ligação entre células endoteliais periventriculares e distúrbios cerebrais. Esses ensaios são simples, de baixo custo e reprodutíveis, e podem ser facilmente adaptados a qualquer tipo de célula aderente.

Introduction

As células endoteliais formam o revestimento dos vasos sanguíneos e mediam funções importantes que incluem manutenção da permeabilidade da parede do vaso, regulação do fluxo sanguíneo, agregação de plaquetas e formação de novos vasos sanguíneos. No cérebro, as células endoteliais fazem parte de uma barreira cerebral-cérebro crítica que controla firmemente a troca de materiais entre o cérebro e a corrente sanguínea¹. Nossos estudos na última década identificaram novos papéis neurogênicos de células endoteliais cerebrais que têm implicações significativas para o desenvolvimento e comportamento cerebral^2,3,4,5. Mostramos que o cérebro embrionário do camundongo é vascularizado por dois subtipos distintos de vasos, os vasos pial e os vasos periventriculares, que diferem em anatomia, origem e perfil de desenvolvimento². Células endoteliais que revestem esses dois subtipos de vasos mostram diferenças distintas em seus perfis de expressão genética. Enquanto as células endoteliais pial expressam principalmente genes relacionados à inflamação e à resposta imune, as células endoteliais periventriculares são enriquecidas exclusivamente na expressão de genes comumente associados à neurogênese, migração neuronal, quimiotaxe e orientação de axôon³. Células endoteliais periventriculares também abrigam um novo caminho de sinalização GABA que é distinto do tradicional caminho de sinalização neuronal GABA⁵. Concomitante com sua expressão genética, células endoteliais periventriculares foram encontradas para regular a migração e distribuição de interneurônios gabaergicos no neocórtex em desenvolvimento. Durante o desenvolvimento embrionário, as células endoteliais periventriculares sofrem migração de longa distância ao longo de um gradiente ventral-dorsal para estabelecer a rede vascular periventricular^2,3. Esta rota migratória é espelhada um dia depois por interneurônios. Os interneurônios migratórios interagem fisicamente com a rede vascular periventricular pré-formada e a usam como um guia para chegar ao seu destino final no neocórtex. Além de atuarem como substrato físico, as células endoteliais periventriculares servem como fonte de sinais de navegação para neurônios migratórios. Gaba endotelicular endotelial de células periventriculares guia a migração interneurônios e regula seus padrões finais de distribuição⁴. Defeitos na migração e distribuição interneurônios estão associados a transtornos neuropsiquiátricos como autismo, epilepsia, esquizofrenia e depressão^6,7,8,9,10. Portanto, o estudo das funções endoteliais endoteliais periventriculares e sua influência na migração interneurônio no contexto humano torna-se fundamental para abordar a patogênese desses transtornos.

Geramos células endoteliais periventriculares humanas a partir de células-tronco embrionárias humanas em nosso laboratório¹¹, usando tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC)^12,13. Para validar se as células endoteliais periventriculares humanas imitam fielmente células endoteliais periventriculares do camundongo e para avaliar quantitativamente sua influência na migração interneurônios, desenvolvemos três ensaios in vitro: um ensaio migratório de longa distância, um ensaio migratório de cocultura e um ensaio de atração de quimioterapia. Aqui descrevemos protocolos para esses ensaios em detalhes. Todos os três ensaios são baseados no uso de pastilhas de cultura de silicone para criar um pequeno retangular de células (de dimensões fixas) cercadas por espaço livre de células. A distância migratória é avaliada medindo a distância entre as posições finais das células da fronteira do patch retangular que foi delineado no dia 0. No ensaio de migração de longa distância, as células endoteliais periventriculares humanas são semeadas como um remendo no centro de uma antena de 35 mm, e as distâncias percorridas pelas células ao longo de um longo período de tempo são calculadas. No ensaio de migração da cocultura, as células endoteliais periventriculares humanas são co-semeadas com interneurônios humanos como um remendo em um prato de 35 mm. Esta configuração permite examinar o efeito das interações físicas diretas desses dois tipos de células na taxa de migração de interneurônios. O ensaio quimio-atração mede a migração de interneurônios em resposta a pistas quimio-atraentes secretadas por células endoteliais periventriculares humanas. Os interneurônios são semeados como um remendo retangular, com células endoteliais periventriculares humanas e controlam células endoteliais não periventriculares semeadas como remendos de tamanho semelhante em ambos os lados. Cada uma das manchas de células são separadas por uma lacuna livre de células de 500 μm. A resposta dos interneurônios é avaliada por quantificar o número de células que migraram para células endoteliais periventriculares em comparação com o controle de células endoteliais não periventriculares.

Esses ensaios fornecem uma avaliação robusta das funções endoteliais eendteliculares humanas e sua influência na migração interneurônios. A nova configuração de ensaio saque de longa distância e ensaio de migração de co-cultura fornece espaço livre de células na faixa de centímetros (~1-1,5 cm) para permitir a detecção da migração de longa distância. Um resumo das características de nossos ensaios em comparação com outros ensaios populares é apresentado na Tabela 1. Coletivamente, os ensaios descritos aqui servirão como uma plataforma para avaliar células endoteliais endoteliais eendrâneos periventriculares “doentes” e interneurônios gerados a partir de iPSCs de distúrbios cerebrais como esquizofrenia, autismo ou epilepsia. Esses ensaios também podem ser usados para determinar como diferentes condições (por exemplo, inibidores, ligands, RNAi) afetam a migração celular. Finalmente, esses ensaios podem ser otimizados para outros tipos de células para medir a migração de longa distância, a atração de quimioterapia ou a migração mediada por células.

Protocol

1. Cultura e Armazenamento de Células Endoteliais Periventriculares Humanas Mantenha células endoteliais periventriculares humanas na membrana do porão revestida saciada (ver Tabela de Materiais) placas de 6 poços em meio de células endoteliais periventriculares (médio E6 contendo 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 e 5 μM GABA) a 37 °C e 5% CO2. Mude o meio todos os dias alternativos. Descongele a matriz de membrana do porão em 4 °C, e faça uma solução de 1:100 di…

Representative Results

Os passos para configurar uma inserção de cultura de um poço dentro de um prato de 35 mm são mostrados na Figura 1. Ensaio seleção de migração de longa distância e ensaio de migração de co-cultura usaram uma inserção de um poço para semear o número desejado de células no centro de uma antena poli-L-ornithine/laminin revestida de 35 mm. No dia 0, as células estavam presentes como um remendo retangular (Figura 2<st…

Discussion

Aqui, descrevemos três ensaios in vitro que, juntos, fornecem avaliação quantitativa de propriedades específicas de células endoteliculares periventriculares humanas. Esses ensaios serão valiosos para obter insights mecanicistas sobre a interação de células endoteliais periventriculares humanas com interneurônios humanos. Experimentos usando ligands, inibidores ou células com knockdown ou superexpressão específicas de genes identificarão ou validarão jogadores moleculares que mediam a migração interneur?…

Materials

Accutase dissociation solution	Millipore Sigma	SCR005	Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)
Anti-human β-Tubulin antibody	Biolegend	802001
Anti-human CD31 antibody	Millipore Sigma	CBL468
Anti- MAP2 antibody	Neuromics	CH22103
Anti-active Caspase 3 antibody	Millipore Sigma	AB3623
Control human endothelial cells	Cellular Dynamics	R1022
Control endothelial Cells Medium Supplement	Cellular Dynamics	M1019
Cryogenic vials	Fisher Scientific	03-337-7Y
DMEMF/12 medium	Thermofisher Scientific	11320033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
E6 medium	Thermofisher Scientific	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientific	PHG0261
Fibronectin	Thermofisher Scientific	33016-015
Freezing Container	Thermofisher Scientific	5100
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Hemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Human GABAergic neurons	Cellular Dynamics	R1013
Human GABAergic neurons base medium	Cellular Dynamics	M1010
Human GABAergic neuron Neural supplement	Cellular Dynamics	M1032
Laminin	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
Mounting Medium	Vector laboratories	H-1200
poly-L-ornithin	Sigma	p4957
PBS	Thermofisher Scientific	14190
Trypan blue	Thermofisher Scientific	15250061
TrypLE	Thermofisher Scientific	12563011	Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	Lifeline Cell Technologies	LL-0003	Component of control human endothelial cell medium
2-well silicone culture-Insert	ibidi	80209
3-well silicone culture-Insert	ibidi	80369
35 mm dish	Corning	430165
15-ml conical tube	Fisher Scientific	07-200-886
4% PFA solution	Fisher Scientific	AAJ19943K2
6-well tissue culture plate	Fisher Scientific	14-832-11
Inverted phase contrast microscope	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
Fluorescent microscope	Olympus	FSX-100