Migration, Chemo-Attraktion und Co-Culture-Assays für menschliche Stammzell-abgeleitete Endothelzellen und GABAerge Neuronen

Zusammenfassung

Wir präsentieren drei einfache In-vitro-Assays – den Fernmigrations-Assay, den Co-Kultur-Migrations-Assay und den Chemo-Attraktions-Assay,der die Funktionen menschlicher Stammzell abgeleiteter periventrikulärer Endothelzellen und deren Interaktion mit GABAerge Interneurons.

Zusammenfassung

Die Rolle der Gehirnvaskulatur bei der Entwicklung des Nervensystems und der Ätiologie von Hirnerkrankungen gewinnt zunehmend an Aufmerksamkeit. Unsere jüngsten Studien haben eine spezielle Population von Gefäßzellen identifiziert, die periventrikulären Endothelzellen, die eine entscheidende Rolle bei der Migration und Verteilung von Vorhirn GABAerge Interneurons während der embryonalen Entwicklung spielen. Dies, gepaart mit ihren zellautonomen Funktionen, spielt auf neue Rollen von periventrikulären Endothelzellen in der Pathologie neuropsychiatrischer Störungen wie Schizophrenie, Epilepsie und Autismus an. Hier haben wir drei verschiedene In-vitro-Assays beschrieben, die gemeinsam die Funktionen periventrikulärer Endothelzellen und deren Wechselwirkung mit GABAergen Interneuronen bewerten. Die Verwendung dieser Assays, insbesondere im menschlichen Kontext, wird es uns ermöglichen, den Zusammenhang zwischen periventrikulären Endothelzellen und Hirnerkrankungen zu identifizieren. Diese Assays sind einfach, kostengünstig und reproduzierbar und können leicht an jeden haftenden Zelltyp angepasst werden.

Einleitung

Endothelzellen bilden die Auskleidung der Blutgefäße und vermitteln wichtige Funktionen, die die Aufrechterhaltung der Durchlässigkeit der Gefäßwand, die Regulierung des Blutflusses, die Thrombozytenaggregation und die Bildung neuer Blutgefäße umfassen. Im Gehirn sind Endothelzellen Teil einer kritischen Blut-Hirn-Schranke, die den Materialaustausch zwischen dem Gehirn und dem Blutkreislauf streng steuert¹. Unsere Studien in den letzten zehn Jahren haben neue neurogene Rollen von Gehirn endothel Zellen identifiziert, die signifikante Auswirkungen auf die Entwicklung des Gehirns und Verhalten^{haben 2,}

Protokoll

1. Kultur und Lagerung menschlicher periventrikulärer Endothelzellen

1. Bewahren Sie menschliche periventrikuläre Endothelzellen auf Kellermembranmatrix-beschichtet (siehe Materialtabelle) 6-Well-Platten in periventrikulärem Endothelzellmedium (E6-Medium mit 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 und 5 'M GABA) bei 37 °C und 5%_CO2. Wechseln Sie das Medium jeden alternativen Tag.
2. Kellermembranmatrix in 4 °C auftauen und eine 1:100-Lösung herstellen, indem man sie in kaltem DMEM/F12-Medium verdünnt. Beschichten Sie jeden Brunnen einer 6-Well-Platte mit 1 ml Matrixlösung. Platten bei 37 °C für mindestens 1 h vor Gebrauch inkubieren.<....

Ergebnisse

Die Schritte zum Einrichten eines Ein-Brunnen-Kultureinsatzes in einer 35-mm-Schale sind in Abbildung 1dargestellt. Der Fernmigrationstest und der Co-Kultur-Migrationstest verwendeten einen Ein-Gut-Einsatz, um die gewünschte Anzahl von Zellen in der Mitte einer Poly-L-Ornithin/Laminin-beschichteten 35-mm-Schale auszusäen. Am Tag 0 waren Zellen als rechteckiges Pflaster vorhanden (Abbildung 2A,C). In Bildern des T.......

Diskussion

Hier haben wir drei In-vitro-Assays beschrieben, die zusammen eine quantitative Bewertung der periventrikulären endothelialen zellspezifischen Eigenschaften des Menschen ermöglichen. Diese Assays werden wertvoll sein, um mechanistische Einblicke in die Wechselwirkung menschlicher periventrikulärer Endothelzellen mit menschlichen Interneuronen zu gewinnen. Experimente mit Liganden, Inhibitoren oder Zellen mit genspezifischem Knockdown oder Überexpression werden molekulare Akteure identifizieren oder validieren, die endoth.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Accutase-Dissoziationslösung	Millipore Sigma	SCR005	Zelldissoziationslösung (für periventrikuläre Endothelzellen, Schritt 1.4)
Anti-Human- β-Tubulin-Antikörper	Biolegend	802001
Anti-humaner CD31-Antikörper	Millipore Sigma	CBL468
Anti-MAP2-Antikörper	Neuromics	CH22103
Antiaktiver Caspase-3-Antikörper	Millipore Sigma	AB3623
Kontrolle menschlicher Endothelzellen	Cellular Dynamics	R1022
Kontrolle Endothelzellen Medium Supplement	Cellular Dynamics	M1019
Kryofläschchen	Fisher Scientific	03-337-7Y
DMEMF/12 Medium	Thermofisher Scientific	11320033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
E6 Medium	Thermofisher Scientific	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientific	PHG0261
Fibronektin	Thermofisher Scientific	33016-015
Gefrierbehälter	Thermofisher Scientific	5100
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Hämazytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Menschliche GABAerge Neuronen	Zelluläre Dynamik	R1013
Menschliche GABAerge Neuronen Basismedium	Zelluläre Dynamik	M1010
Menschliches GABAerges Neuron Neuronale Ergänzung	Zelluläre Dynamik	M1032
Laminin	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	356230	Basalmembran-Matrix
Eindeckmedium	Vektorlaboratorien	H-1200
Poly-L-Ornithin	Sigma	p4957
PBS	Thermofisher Scientific	14190
Trypanblau	Thermofisher Scientific	15250061
TrypLE	Thermofisher Wissenschaftliche	12563011	Zelldissoziationslösung (für GABAerge Interneurone und Endothelzellen, Abschnitte 3 und 4)
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	Lifeline Cell Technologies	LL-0003	Komponente der Kontrolle humanes Endothelzellmedium
2-Well-Silikonkultur-Insert	ibidi	80209
3-Well-Silikon Kultur-Einsatz	ibidi	80369
35 mm Schale	Corning	430165
15-ml konisches Röhrchen	Fisher Scientific	07-200-886
4% PFA-Lösung	Fisher Scientific	AAJ19943K2
6-Well-Gewebekulturplatte	Fisher Scientific	14-832-11
Inverses Phasenkontrastmikroskop	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
Leuchtstoffmikroskop	Olympus	FSX-100