Migration, Chemo-Attraktion und Co-Culture-Assays für menschliche Stammzell-abgeleitete Endothelzellen und GABAerge Neuronen

Summary

Wir präsentieren drei einfache In-vitro-Assays – den Fernmigrations-Assay, den Co-Kultur-Migrations-Assay und den Chemo-Attraktions-Assay,der die Funktionen menschlicher Stammzell abgeleiteter periventrikulärer Endothelzellen und deren Interaktion mit GABAerge Interneurons.

Abstract

Die Rolle der Gehirnvaskulatur bei der Entwicklung des Nervensystems und der Ätiologie von Hirnerkrankungen gewinnt zunehmend an Aufmerksamkeit. Unsere jüngsten Studien haben eine spezielle Population von Gefäßzellen identifiziert, die periventrikulären Endothelzellen, die eine entscheidende Rolle bei der Migration und Verteilung von Vorhirn GABAerge Interneurons während der embryonalen Entwicklung spielen. Dies, gepaart mit ihren zellautonomen Funktionen, spielt auf neue Rollen von periventrikulären Endothelzellen in der Pathologie neuropsychiatrischer Störungen wie Schizophrenie, Epilepsie und Autismus an. Hier haben wir drei verschiedene In-vitro-Assays beschrieben, die gemeinsam die Funktionen periventrikulärer Endothelzellen und deren Wechselwirkung mit GABAergen Interneuronen bewerten. Die Verwendung dieser Assays, insbesondere im menschlichen Kontext, wird es uns ermöglichen, den Zusammenhang zwischen periventrikulären Endothelzellen und Hirnerkrankungen zu identifizieren. Diese Assays sind einfach, kostengünstig und reproduzierbar und können leicht an jeden haftenden Zelltyp angepasst werden.

Introduction

Endothelzellen bilden die Auskleidung der Blutgefäße und vermitteln wichtige Funktionen, die die Aufrechterhaltung der Durchlässigkeit der Gefäßwand, die Regulierung des Blutflusses, die Thrombozytenaggregation und die Bildung neuer Blutgefäße umfassen. Im Gehirn sind Endothelzellen Teil einer kritischen Blut-Hirn-Schranke, die den Materialaustausch zwischen dem Gehirn und dem Blutkreislauf streng steuert¹. Unsere Studien in den letzten zehn Jahren haben neue neurogene Rollen von Gehirn endothel Zellen identifiziert, die signifikante Auswirkungen auf die Entwicklung des Gehirns und Verhalten^{haben 2,3,4,5}. Wir haben gezeigt, dass das embryonale Vorderhirn der Maus durch zwei verschiedene Subtypen von Gefäßen, die pialen Gefäße und die periventrikulären Gefäße, die sich in Anatomie, Herkunft und Entwicklungsprofil^{unterscheiden,}vaskularisiert wird 2 . Endothelzellen, die diese beiden Gefäßsubtypen aussäumen, weisen deutliche Unterschiede in ihren Genexpressionsprofilen auf. Während piale Endothelzellen meist Gene exprimieren, die mit Entzündungen und Immunantwort zusammenhängen, sind periventrikuläre Endothelzellen einzigartig angereichert in der Expression von Genen, die häufig mit Neurogenese, neuronaler Migration, Chemotaxis und Axonführung assoziiert sind³. Periventrikuläre Endothelzellen beherbergen auch einen neuartigen GABA-Signalweg, der sich vom traditionellen neuronalen GABA-Signalweg⁵unterscheidet. Gleichzeitig mit seiner Genexpression, periventrikuläre Endothelzellen wurden gefunden, um Migration und Verteilung von GABAergen Interneuronen in der sich entwickelnden Neocortex zu regulieren. Während der embryonalen Entwicklung durchlaufen periventrikuläre Endothelzellen eine Fernmigration entlang eines ventral-dorsalen Gradienten, um das periventrikuläre Gefäßnetz^2,3zu etablieren. Diese Migrationsroute wird einen Tag später von Interneuren gespiegelt. Migrierende Interneuroner interagieren physisch mit dem vorgebildeten periventrikulären Gefäßnetz und nutzen es als Leitlinie, um ihr endgültiges Ziel im Neocortex zu erreichen. Periventrikuläre Endothelzellen dienen nicht nur als physikalisches Substrat, sondern dienen auch als Quelle für Navigationshinweise für die Migration von Neuronen. Periventrikuläre endotheliale Zellsekretierte GABA leitet interneuron Migration und reguliert ihre endgültigen Verteilungsmuster⁴. Defekte in interneuron Migration und Verteilung sind mit neuropsychiatrischen Störungen wie Autismus, Epilepsie, Schizophrenie und Depression^6,7,8,9,10verbunden. Daher wird die Untersuchung der periventrikulären Endothelzellfunktionen und ihres Einflusses auf die interneuronische Migration im menschlichen Kontext entscheidend für die Bekämpfung der Pathogenese dieser Störungen.

Wir haben menschliche periventrikuläre Endothelzellen aus menschlichen embryonalen Stammzellen in unserem Labor¹¹mit induzierter pluripotenter Stammzelltechnologie (iPSC)^12,13erzeugt. Um zu validieren, ob menschliche periventrikuläre Endothelzellen die periventrikulären Endothelzellen der Maus originalgetreu imitieren und ihren Einfluss auf die interneuronische Migration quantitativ bewerten können, entwickelten wir drei In-vitro-Assays: einen Fernmigrationstest, einen Co-Kultur-Migrationstest und einen Chemo-Attraktions-Assay. Hier beschreiben wir Protokolle für diese Assays im Detail. Alle drei Assays basieren auf der Verwendung von Silikonkultureinsätzen, um einen kleinen rechteckigen Zellfleck (mit festen Abmessungen) zu erstellen, der von zellfreiem Raum umgeben ist. Der Migrationsabstand wird ausgewertet, indem der Abstand zwischen den endlaufenden Positionen von Zellen vom Rand des rechteckigen Patches gemessen wird, der am Tag 0 umrissen wurde. Im Fernwanderungstest werden menschliche periventrikuläre Endothelzellen als Pflaster in der Mitte einer 35-mm-Schale ausgesät, und die von den Zellen über einen langen Zeitraum zurückgelegten Entfernungen werden berechnet. Im Co-Kultur-Migrationstest werden menschliche periventrikuläre Endothelzellen mit menschlichen Interneuronen als ein Pflaster in einer 35-mm-Schale mitgesät. Diese Einrichtung ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen direkter physischer Wechselwirkungen dieser beiden Zelltypen auf die Migrationsrate von Interneuronen. Der Chemo-Attraktionstest misst die Migration von Interneuronen als Reaktion auf chemoattraktive Hinweise, die von menschlichen periventrikulären Endothelzellen sezerniert werden. Interneuronen werden als rechteckiges Pflaster mit menschlichen periventrikulären Endothelzellen gesät und kontrollieren nicht-periventrikuläre Endothelzellen, die als ähnlich große Pflaster auf beiden Seiten gesät werden. Jede der Zellpflaster wird durch einen zellfreien Spalt von 500 m getrennt. Die Reaktion von Interneuronen wird durch Quantifizierung der Anzahl der Zellen, die zu periventrikulären endothelialen Zellen gewandert sind, im Vergleich zur Kontrolle nicht-periventrikulärer endotheliale Zellen bewertet.

Diese Assays liefern eine robuste Bewertung der funktionen der humanen periventrikulären Endothelzellen und ihres Einflusses auf die interneuronische Migration. Die neuartige Einrichtung des Fernassays und des Co-Kultur-Migrations-Assays bietet zellfreien Raum im Bereich von Zentimetern (1-1,5 cm), um die Erkennung von Fernmigration zu ermöglichen. Eine Zusammenfassung der Merkmale unserer Assays im Vergleich zu anderen populären Assays ist in Tabelle 1dargestellt. Gemeinsam werden die hier beschriebenen Assays als Plattform für die Bewertung “kranker” periventrikulärer Endothelzellen und Interneuronen dienen, die aus iPSCs von Hirnerkrankungen wie Schizophrenie, Autismus oder Epilepsie erzeugt werden. Diese Assays können auch verwendet werden, um zu bestimmen, wie unterschiedliche Bedingungen (z. B. Inhibitoren, Liganden, RNAi) die Zellmigration beeinflussen. Schließlich können diese Assays für andere Zelltypen optimiert werden, um die Migration über die Ferne, die Chemo-Attraktion oder die zellzellvermittelte Migration zu messen.

Protocol

1. Kultur und Lagerung menschlicher periventrikulärer Endothelzellen Bewahren Sie menschliche periventrikuläre Endothelzellen auf Kellermembranmatrix-beschichtet (siehe Materialtabelle) 6-Well-Platten in periventrikulärem Endothelzellmedium (E6-Medium mit 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 und 5 ‘M GABA) bei 37 °C und 5%CO2. Wechseln Sie das Medium jeden alternativen Tag. Kellermembranmatrix in 4 °C auftauen und eine 1:100-Lösung herstellen, indem man sie in kaltem DMEM/…

Representative Results

Die Schritte zum Einrichten eines Ein-Brunnen-Kultureinsatzes in einer 35-mm-Schale sind in Abbildung 1dargestellt. Der Fernmigrationstest und der Co-Kultur-Migrationstest verwendeten einen Ein-Gut-Einsatz, um die gewünschte Anzahl von Zellen in der Mitte einer Poly-L-Ornithin/Laminin-beschichteten 35-mm-Schale auszusäen. Am Tag 0 waren Zellen als rechteckiges Pflaster vorhanden (Abbildung 2A,C). In Bildern des…

Discussion

Hier haben wir drei In-vitro-Assays beschrieben, die zusammen eine quantitative Bewertung der periventrikulären endothelialen zellspezifischen Eigenschaften des Menschen ermöglichen. Diese Assays werden wertvoll sein, um mechanistische Einblicke in die Wechselwirkung menschlicher periventrikulärer Endothelzellen mit menschlichen Interneuronen zu gewinnen. Experimente mit Liganden, Inhibitoren oder Zellen mit genspezifischem Knockdown oder Überexpression werden molekulare Akteure identifizieren oder validieren, die en…

Materials

Accutase dissociation solution	Millipore Sigma	SCR005	Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)
Anti-human β-Tubulin antibody	Biolegend	802001
Anti-human CD31 antibody	Millipore Sigma	CBL468
Anti- MAP2 antibody	Neuromics	CH22103
Anti-active Caspase 3 antibody	Millipore Sigma	AB3623
Control human endothelial cells	Cellular Dynamics	R1022
Control endothelial Cells Medium Supplement	Cellular Dynamics	M1019
Cryogenic vials	Fisher Scientific	03-337-7Y
DMEMF/12 medium	Thermofisher Scientific	11320033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
E6 medium	Thermofisher Scientific	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientific	PHG0261
Fibronectin	Thermofisher Scientific	33016-015
Freezing Container	Thermofisher Scientific	5100
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Hemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Human GABAergic neurons	Cellular Dynamics	R1013
Human GABAergic neurons base medium	Cellular Dynamics	M1010
Human GABAergic neuron Neural supplement	Cellular Dynamics	M1032
Laminin	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
Mounting Medium	Vector laboratories	H-1200
poly-L-ornithin	Sigma	p4957
PBS	Thermofisher Scientific	14190
Trypan blue	Thermofisher Scientific	15250061
TrypLE	Thermofisher Scientific	12563011	Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	Lifeline Cell Technologies	LL-0003	Component of control human endothelial cell medium
2-well silicone culture-Insert	ibidi	80209
3-well silicone culture-Insert	ibidi	80369
35 mm dish	Corning	430165
15-ml conical tube	Fisher Scientific	07-200-886
4% PFA solution	Fisher Scientific	AAJ19943K2
6-well tissue culture plate	Fisher Scientific	14-832-11
Inverted phase contrast microscope	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
Fluorescent microscope	Olympus	FSX-100