Migratie, Chemo-Attraction, en Co-Culture Assays voor menselijke stamcel-afgeleide endotheelcellen en GABAergic Neuronen

Summary

We presenteren drie eenvoudige in vitro testen-de lange afstand migratie test, de co-cultuur migratie test, en chemo-attractie test-dat gezamenlijk evalueren van de functies van de menselijke stamcel afgeleid periventricular endotheliale cellen en hun interactie met GABAergic interneuronen.

Abstract

Rol van hersenvasculatuur in de ontwikkeling van het zenuwstelsel en etiologie van hersenaandoeningen krijgt steeds meer aandacht. Onze recente studies hebben een speciale populatie van vasculaire cellen geïdentificeerd, de periventrtriculaire endotheelcellen, die een cruciale rol spelen bij de migratie en distributie van voorhersenen GABAergic interneuronen tijdens de embryonale ontwikkeling. Dit, in combinatie met hun cel-autonome functies, zinspeelt op nieuwe rollen van periventricular endotheliale cellen in de pathologie van neuropsychiatrische stoornissen zoals schizofrenie, epilepsie en autisme. Hier hebben we drie verschillende in vitro tests beschreven die gezamenlijk de functies van periventricular endotheliale cellen en hun interactie met GABAergic interneuronen evalueren. Het gebruik van deze tests, met name in een menselijke context, zal ons in staat stellen om het verband tussen periventricular endotheliale cellen en hersenaandoeningen te identificeren. Deze tests zijn eenvoudig, lage kosten, en reproduceerbaar, en kan gemakkelijk worden aangepast aan elk aanhangend celtype.

Introduction

Endotheelcellen vormen het slijmvlies van bloedvaten en bemiddelen belangrijke functies zoals het onderhoud van de doorlaatbaarheid van de vaatwand, regulering van de bloedstroom, bloedplaatjesaggregatie en vorming van nieuwe bloedvaten. In de hersenen maken endotheelcellen deel uit van een kritische bloed-hersenbarrière die de uitwisseling van materialen tussen de hersenen en de bloedbaan strak controleert¹. Onze studies in het afgelopen decennium hebben nieuwe neurogene rollen van hersenendotheliale cellen geïdentificeerd die aanzienlijke implicaties hebben voor de ontwikkeling van de hersenen en gedrag^2,3,4,5. We hebben aangetoond dat de embryonale voorhersenen van de muis gevasculariseerd is door twee verschillende subtypen vaten, de pialvaten en de periventrculaire vaten, die verschillen in anatomie, oorsprong en ontwikkelingsprofiel². Endotheelcellen langs deze twee soorten vaartuigen vertonen duidelijke verschillen in hun genexpressieprofielen. Terwijl piale endotheelcellen meestal genen met betrekking tot ontsteking en immuunrespons uitdrukken, zijn periventrtriculaire endotheelcellen uniek verrijkt in expressie van genen die vaak geassocieerd worden met neurogenese, neuronale migratie, chemotaxis en axonbegeleiding³. Periventricular endotheliale cellen ook huis een nieuwe GABA signalering pad dat is onderscheiden van de traditionele neuronale GABA signalering pad⁵. Gelijktijdig met zijn genexpressie bleken periventrtriculaire endotheelcellen de migratie en distributie van GABAergic interneuronen in de zich ontwikkelende neocortex te reguleren. Tijdens de embryonale ontwikkeling ondergaan periventricular endotheliale cellen langdurige migratie langs een ventrale ruggradiënt om het periventrtriculaire vasculaire netwerk vast te stellen^2,3. Deze migratieroute wordt een dag later gespiegeld door interneuronen. Migrerende interneuronen interageren fysiek met het vooraf gevormde periventrtriculaire vasculaire netwerk en gebruiken het als een geleiderail om hun eindbestemming in de neocortex te bereiken. Naast het fungeren als een fysiek substraat, periventricular endotheliale cellen dienen als de bron van navigatie signalen voor migrerende neuronen. Periventricular endotheliale cel-uitgescheiden GABA gidsen interneuron migratie en reguleert hun uiteindelijke distributie patronen⁴. Defecten in interneuron migratie en distributie worden geassocieerd met neuropsychiatrische stoornissen zoals autisme, epilepsie, schizofrenie en depressie^6,7,8,9,10. Daarom wordt studie van periventricular endotheliale celfuncties en hun invloed op interneuronmigratie in menselijke context van cruciaal belang voor het aanpakken van de pathogenese van deze aandoeningen.

We hebben menselijke periventrtriculaire-achtige endotheelcellen gegenereerd uit menselijke embryonale stamcellen in ons laboratorium¹¹, met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) technologie^12,13. Om te valideren of menselijke periventricular endotheelcellen getrouw muisperiventricular endotheliale cellen nabootsen, en om hun invloed op interneuronmigratie kwantitatief te beoordelen, ontwikkelden we drie in vitro tests: een lange afstandsmigratietest, een co-cultuurmigratietest en een chemo-aantrekkelijkheidstest. Hier beschrijven we protocollen voor deze testen in detail. Alle drie de tests zijn gebaseerd op het gebruik van siliconen cultuur inserts om een kleine rechthoekige patch van cellen (van vaste afmetingen) omgeven door celvrije ruimte te creëren. Migratieafstand wordt geëvalueerd door de afstand tussen de eindposities van cellen te meten vanaf de rand van de rechthoekige patch die op dag 0 is beschreven. In de lange afstand migratie test, menselijke periventricular endotheliale cellen worden gezaaid als een patch in het midden van een 35 mm schotel, en de afstanden afgelegd door de cellen over een lange reeks van tijd worden berekend. In de co-cultuur migratie test, menselijke periventricular endotheliale cellen zijn co-gezaaid met menselijke interneuronen als een patch in een 35 mm schotel. Deze opstelling maakt het mogelijk om het effect van directe fysieke interacties van deze twee celtypen op de mate van migratie van interneuronen te onderzoeken. De chemo-attractie test meet de migratie van interneuronen in reactie op chemo-aantrekkelijke signalen afgescheiden door menselijke periventricular endotheliale cellen. Interneuronen worden gezaaid als een rechthoekige patch, met menselijke periventrtriculaire endotheelcellen en controle niet-perivefntricular endotheliale cellen gezaaid als vergelijkbare grootte patches aan weerszijden. Elk van de celpleisters wordt gescheiden door een celvrije kloof van 500 μm. De respons van interneuronen wordt beoordeeld door het aantal cellen te kwantificeren dat naar periventricular endotheliale cellen is gemigreerd in vergelijking met de controle van niet-periventrtriculaire endotheelcellen.

Deze tests bieden een robuuste beoordeling van menselijke periventricular endotheliale celfuncties en hun invloed op interneuron migratie. De nieuwe opzet van lange afstand test en co-cultuur migratie test biedt cel-vrije ruimte in het bereik van centimeters (~ 1-1,5 cm) om detectie van lange afstand migratie mogelijk te maken. Een samenvatting van de kenmerken van onze tests in vergelijking met andere populaire tests wordt gepresenteerd in tabel 1. Gezamenlijk, de testen hier beschreven zal dienen als een platform voor de beoordeling van “zieke” periventricular endotheliale cellen en interneuronen gegenereerd uit iPSCs van hersenaandoeningen zoals schizofrenie, autisme of epilepsie. Deze tests kunnen ook worden gebruikt om te bepalen hoe verschillende aandoeningen (bijvoorbeeld remmers, liganden, RNAi) de celmigratie beïnvloeden. Ten slotte kunnen deze tests worden geoptimaliseerd voor andere celtypen om migratie over lange afstand, chemo-aantrekkingskracht of celcelgemedieerde migratie te meten.

Protocol

1. Cultuur en opslag van menselijke periventrtriculaire endotheliale cellen Handhaven van menselijke periventrtriculaire endotheelcellen op keldermembraan matrix-gecoate (zie Tabel van Materialen) 6-put platen in periventricular endotheliale celmedium (E6 medium met 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 en 5 μM GABA) bij 37 °C en 5% CO2. Verander elke dag van medium. Ontdooi keldermembraanmatrix in 4 °C en maak een 1:100 oplossing door deze te verdunnen in koud DMEM/F12 medium…

Representative Results

De stappen voor het opzetten van een een-goed cultuur insert in een 35 mm schotel zijn weergegeven in figuur 1. Lange afstand migratie test en co-cultuur migratie test gebruikt een een-goed insert om het gewenste aantal cellen zaad in het midden van een poly-L-ornithine / laminin gecoate 35 mm schotel. Op dag 0 waren cellen aanwezig als rechthoekige patch(figuur 2A,C). In beelden van dag 0 kan de lijn van dag 0 g…

Discussion

Hier beschreven we drie in vitro tests die samen kwantitatieve beoordeling van menselijke periventricular endotheliale cel-specifieke eigenschappen bieden. Deze tests zullen waardevol zijn bij het verkrijgen van mechanistische inzichten in de interactie van menselijke periventrtriculaire endotheliale cellen met menselijke interneuronen. Experimenten met liganden, remmers of cellen met genspecifieke knockdown of overexpressie zullen moleculaire spelers identificeren of valideren die endotheliale celgestuurde interneuronmi…

Materials

Accutase dissociation solution	Millipore Sigma	SCR005	Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)
Anti-human β-Tubulin antibody	Biolegend	802001
Anti-human CD31 antibody	Millipore Sigma	CBL468
Anti- MAP2 antibody	Neuromics	CH22103
Anti-active Caspase 3 antibody	Millipore Sigma	AB3623
Control human endothelial cells	Cellular Dynamics	R1022
Control endothelial Cells Medium Supplement	Cellular Dynamics	M1019
Cryogenic vials	Fisher Scientific	03-337-7Y
DMEMF/12 medium	Thermofisher Scientific	11320033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
E6 medium	Thermofisher Scientific	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientific	PHG0261
Fibronectin	Thermofisher Scientific	33016-015
Freezing Container	Thermofisher Scientific	5100
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Hemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Human GABAergic neurons	Cellular Dynamics	R1013
Human GABAergic neurons base medium	Cellular Dynamics	M1010
Human GABAergic neuron Neural supplement	Cellular Dynamics	M1032
Laminin	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
Mounting Medium	Vector laboratories	H-1200
poly-L-ornithin	Sigma	p4957
PBS	Thermofisher Scientific	14190
Trypan blue	Thermofisher Scientific	15250061
TrypLE	Thermofisher Scientific	12563011	Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	Lifeline Cell Technologies	LL-0003	Component of control human endothelial cell medium
2-well silicone culture-Insert	ibidi	80209
3-well silicone culture-Insert	ibidi	80369
35 mm dish	Corning	430165
15-ml conical tube	Fisher Scientific	07-200-886
4% PFA solution	Fisher Scientific	AAJ19943K2
6-well tissue culture plate	Fisher Scientific	14-832-11
Inverted phase contrast microscope	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
Fluorescent microscope	Olympus	FSX-100