मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न एंडोथेलियल कोशिकाओं और गैबाएर्गिक न्यूरॉन्स के लिए प्रवासन, कीमो-आकर्षण और सह-संस्कृति परख
Summary
हम तीन सरल इन विट्रो परख प्रस्तुत-लंबी दूरी के प्रवास परख, सह संस्कृति प्रवास परख, और कीमो आकर्षण परख-कि सामूहिक रूप से मानव स्टेम सेल के कार्यों का मूल्यांकन पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं और उनके गैबाएर्गिक इंटरन्यूरॉन्स के साथ बातचीत।
Abstract
तंत्रिका तंत्र के विकास और मस्तिष्क विकारों के एटिजियोलॉजी में मस्तिष्क वास्कुलचर की भूमिका तेजी से ध्यान आकर्षित कर रही है। हमारे हाल के अध्ययनों ने संवहनी कोशिकाओं की एक विशेष आबादी की पहचान की है, पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं, जो भ्रूणीय विकास के दौरान अग्रमस्तिष्क गैबाएर्गिक इंटरन्यूरॉन्स के प्रवास और वितरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। यह, उनके सेल-स्वायत्त कार्यों के साथ मिलकर, सिजोफ्रेनिया, मिर्गी और आत्मकेंद्रित जैसे न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारों की विकृति में पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं की उपन्यास भूमिकाओं के लिए संकेत देता है। यहां, हमने तीन अलग-अलग इन विट्रो परखों का वर्णन किया है जो सामूहिक रूप से पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के कार्यों और गैबाएर्गिक इंटरन्यूरॉन्स के साथ उनकी बातचीत का मूल्यांकन करते हैं। विशेष रूप से मानव संदर्भ में इन परखों का उपयोग, हमें पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं और मस्तिष्क विकारों के बीच की कड़ी की पहचान करने की अनुमति देगा। ये परख सरल, कम लागत और प्रजनन योग्य हैं, और आसानी से किसी भी अनुयायी सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
एंडोथेलियल कोशिकाएं रक्त वाहिकाओं की परत बनाती हैं और महत्वपूर्ण कार्यों में मध्यस्थता करती हैं जिनमें पोत की दीवार परगम्यता का रखरखाव, रक्त प्रवाह का विनियमन, प्लेटलेट एकत्रीकरण और नई रक्त वाहिकाओं का गठन शामिल है। मस्तिष्क में, एंडोथेलियल कोशिकाएं एक महत्वपूर्ण रक्त-मस्तिष्क-बाधा का हिस्सा बनती हैं जो मस्तिष्क और रक्त प्रवाह1के बीच सामग्रियों के आदान-प्रदान को कसकर नियंत्रित करती है। पिछले एक दशक में हमारे अध्ययनों ने मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाओं की उपन्यास न्यूरोजेनिक भूमिकाओं की पहचान की है जिनका मस्तिष्क विकास और व्यवहार2,3,4,5के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं । हमने दिखाया है कि माउस भ्रूणीय अग्रमस्तिष्क दो अलग-अलग उपप्रकार के जहाजों, पियाल जहाजों और पेरिवेंट्रिकुलर जहाजों द्वारा संवहनी है, जो शरीर रचना विज्ञान, मूल और विकासात्मक प्रोफ़ाइल2में भिन्न होते हैं। एंडोथेलियल कोशिकाएं इन दो पोत उपप्रकारों को अस्तर करती हैं, जो उनके जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल में अलग अंतर दिखाती हैं। जबकि पियाल एंडोथेलियल कोशिकाएं ज्यादातर सूजन और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से संबंधित जीन व्यक्त करती हैं, पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं आमतौर पर न्यूरोजेनेसिस, न्यूरोनल माइग्रेशन, कीमोटैक्सिस और एक्सॉन गाइडेंस3से जुड़े जीन की अभिव्यक्ति में विशिष्ट रूप से समृद्ध होती हैं। पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं में एक उपन्यास गाबा सिग्नलिंग पाथवे भी है जो पारंपरिक न्यूरोनल गाबा सिग्नलिंग पाथवे5से अलग है । इसकी जीन अभिव्यक्ति के साथ सहवर्ती, पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को विकासशील नियोकॉर्टेक्स में गैबाएर्गिक इंटरन्यूरॉन्स के प्रवास और वितरण को विनियमित करने के लिए पाया गया था। भ्रूणीय विकास के दौरान, पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को पेरिवेंट्रिकुलर वैस्कुलर नेटवर्क2,3स्थापित करने के लिए एक वेंट्रल-पृष्ठीय ढाल के साथ लंबी दूरी के प्रवास से गुजरना पड़ता है। यह प्रवासी मार्ग एक दिन बाद इंटरन्यूरॉन्स द्वारा प्रतिबिंबित होता है। माइग्रेट इंटरन्यूरॉन्स शारीरिक रूप से पूर्व-गठित पेरिवेंट्रिकुलर वैस्कुलर नेटवर्क के साथ बातचीत करते हैं और नियोकॉर्टेक्स में अपने अंतिम गंतव्य तक पहुंचने के लिए इसे गाइडरेल के रूप में उपयोग करते हैं। एक भौतिक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करने के अलावा, पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं न्यूरॉन्स को माइग्रेट करने के लिए नौवहन संकेतों के स्रोत के रूप में काम करती हैं। पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल सेल-स्रावित गाबा इंटरन्यूरॉन माइग्रेशन का मार्गदर्शन करता है और उनके अंतिम वितरण पैटर्न4को नियंत्रित करता है। इंटरन्यूरॉन माइग्रेशन और वितरण में दोष ऑटिज्म, मिर्गी, सिजोफ्रेनिया और अवसाद6,7,8,9,10जैसे न्यूरोसाइकियाट्रिक विकारों से जुड़े होते हैं। इसलिए, पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल सेल कार्यों का अध्ययन और मानव संदर्भ में इंटरन्यूरॉन माइग्रेशन पर उनका प्रभाव इन विकारों के रोगजनन को संबोधित करने के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है।
हमने अपनी प्रयोगशाला11में मानव भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से मानव पेरिवेंट्रिकुलर जैसी एंडोथेलियल कोशिकाओं को उत्पन्न किया है, जो प्रेरित प्लुरीपोटेवल स्टेम सेल (आईपीएससी) प्रौद्योगिकी12,13का उपयोग कररहे हैं। यह मान्य करने के लिए कि क्या मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं ईमानदारी से माउस पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं की नकल करती हैं, और मात्रात्मक रूप से इंटरन्यूरॉन माइग्रेशन पर उनके प्रभाव का आकलन करने के लिए, हमने तीन इन विट्रो परख विकसित की: एक लंबी दूरी की प्रवास परख, एक सह-संस्कृति प्रवास परख, और एक कीमो-आकर्षण परख। यहां हम इन परखों के लिए प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं । सभी तीन परख सिलिकॉन संस्कृति आवेषण के उपयोग पर आधारित करने के लिए कोशिकाओं का एक छोटा आयताकार पैच बनाने के लिए (निश्चित आयामों की) सेल मुक्त अंतरिक्ष से घिरा हुआ है । 0 दिन में उल्लिखित आयताकार पैच की सीमा से कोशिकाओं की अंतिम स्थितियों के बीच की दूरी को मापने के द्वारा माइग्रेशन दूरी का मूल्यांकन किया जाता है। लंबी दूरी की प्रवास परख में, मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को 35 मिमी पकवान के केंद्र में एक पैच के रूप में वरीयता दी जाती है, और लंबे समय तक कोशिकाओं द्वारा कूच की गई दूरियों की गणना की जाती है। सह-संस्कृति प्रवास परख में, मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को 35 मिमी पकवान में एक पैच के रूप में मानव इंटरन्यूरॉन्स के साथ सह-वरीयता प्राप्त किया जाता है। यह सेटअप इंटरन्यूरॉन्स के माइग्रेशन की दर पर इन दो सेल प्रकारों के प्रत्यक्ष शारीरिक बातचीत के प्रभाव की परीक्षा की अनुमति देता है। कीमो-आकर्षण परख मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा स्रावित कीमो-आकर्षक संकेतों के जवाब में इंटरन्यूरॉन्स के प्रवास को मापता है। इंटरन्यूरॉन्स को आयताकार पैच के रूप में वरीयता दी जाती है, जिसमें मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं होती हैं और दोनों तरफ समान आकार के पैच के रूप में वरीयता प्राप्त गैर-पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को नियंत्रित करती हैं। प्रत्येक कोशिका पैच को 500 माइक्रोन के सेल-मुक्त अंतर से अलग किया जाता है। अंतरन्यूरॉन्स की प्रतिक्रिया का मूल्यांकन उन कोशिकाओं की संख्या को निर्धारित करके किया जाता है जो गैर-पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को नियंत्रित करने की तुलना में पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं की ओर चले गए हैं।
ये परख मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल सेल कार्यों और इंटरन्यूरॉन माइग्रेशन पर उनके प्रभाव का मजबूत आकलन प्रदान करते हैं। लंबी दूरी की परख और सह-संस्कृति प्रवास परख का उपन्यास सेटअप लंबी दूरी के प्रवास का पता लगाने की अनुमति देने के लिए सेंटीमीटर (~ 1-1.5 सेमी) की सीमा में सेल-मुक्त स्थान प्रदान करता है। अन्य लोकप्रिय परखों की तुलना में हमारे परखों की विशेषताओं का सारांश तालिका 1में प्रस्तुत किया गया है । सामूहिक रूप से, यहां वर्णित परखों से सिजोफ्रेनिया, ऑटिज्म या मिर्गी जैसे मस्तिष्क विकारों के आईपीएससी से उत्पन्न “रोगग्रस्त” पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं और इंटरन्यूरॉन्स का आकलन करने के लिए एक मंच के रूप में काम करेगा । इन परखों का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए भी किया जा सकता है कि विभिन्न स्थितियां (जैसे अवरोधक, लिगांड, आरएनएआई) सेल माइग्रेशन को कैसे प्रभावित करती हैं। अंत में, इन परखों को लंबी दूरी के प्रवास, कीमो-आकर्षण या सेल-सेल मध्यस्थता प्रवास को मापने के लिए अन्य सेल प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हमने तीन इन विट्रो परखों का वर्णन किया है कि एक साथ मानव पेरिवेंट्रिकुलर एंडोथेलियल सेल-विशिष्ट गुणों का मात्रात्मक आकलन प्रदान करते हैं। ये परख मानव अंतरन्यूरॉन्स के साथ मानव पेरिवेंट्रिकुलर …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय मानसिक स्वास्थ्य संस्थान (R01MH110438) और राष्ट्रीय न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (R01NS100808) से एवी को पुरस्कारों से समर्थन मिला ।
Materials
| Accutase dissociation solution | Millipore Sigma | SCR005 | Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4) |
| Anti-human β-Tubulin antibody | Biolegend | 802001 | |
| Anti-human CD31 antibody | Millipore Sigma | CBL468 | |
| Anti- MAP2 antibody | Neuromics | CH22103 | |
| Anti-active Caspase 3 antibody | Millipore Sigma | AB3623 | |
| Control human endothelial cells | Cellular Dynamics | R1022 | |
| Control endothelial Cells Medium Supplement | Cellular Dynamics | M1019 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 03-337-7Y | |
| DMEMF/12 medium | Thermofisher Scientific | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| E6 medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
| FGF2 | Thermofisher Scientific | PHG0261 | |
| Fibronectin | Thermofisher Scientific | 33016-015 | |
| Freezing Container | Thermofisher Scientific | 5100 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Human GABAergic neurons | Cellular Dynamics | R1013 | |
| Human GABAergic neurons base medium | Cellular Dynamics | M1010 | |
| Human GABAergic neuron Neural supplement | Cellular Dynamics | M1032 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
| Mounting Medium | Vector laboratories | H-1200 | |
| poly-L-ornithin | Sigma | p4957 | |
| PBS | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| Trypan blue | Thermofisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE | Thermofisher Scientific | 12563011 | Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4) |
| VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | Lifeline Cell Technologies | LL-0003 | Component of control human endothelial cell medium |
| 2-well silicone culture-Insert | ibidi | 80209 | |
| 3-well silicone culture-Insert | ibidi | 80369 | |
| 35 mm dish | Corning | 430165 | |
| 15-ml conical tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 4% PFA solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| Inverted phase contrast microscope | Zeiss | Zeiss Axiovert 40C | |
| Fluorescent microscope | Olympus | FSX-100 |
References
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