Migrasjon, kjemo-attraksjon og co-kultur analyser for menneskelige stamcelle-avledet endotelceller og GABAergic Nevroner

Summary

Vi presenterer tre enkle in vitro analyser-langdistanse migrasjon analyse, co-kultur migrasjon analyse, og kjemo-attraksjon analyse-som kollektivt vurdere funksjonene til menneskelige stamcelle avledet periventtrikulær endotelceller og deres interaksjon med GABAerge interneuroner.

Abstract

Rollen til hjernens vaskulatur i nervesystemet utvikling og etiologi av hjernesykdommer blir stadig mer oppmerksomhet. Våre nyere studier har identifisert en spesiell populasjon av vaskulære celler, periventtrikulære endotelceller, som spiller en kritisk rolle i migrering og distribusjon av forebrain GABAergic interneurons under embryonisk utvikling. Dette, kombinert med deres celle-autonome funksjoner, hentydder til nye roller av periventtrikulære endotelceller i patologien til nevropsykiatriske lidelser som schizofreni, epilepsi og autisme. Her har vi beskrevet tre forskjellige in vitro analyser som kollektivt evaluerefunksjonene til periventtrikulære endotelceller og deres interaksjon med GABAergic interneurons. Bruk av disse analysene, spesielt i menneskelig sammenheng, vil tillate oss å identifisere sammenhengen mellom periventtrikulære endotelceller og hjernesykdommer. Disse analysene er enkle, lave kostnader og reproduserbare, og kan enkelt tilpasses enhver tilhengercelletype.

Introduction

Endotelceller danner foring av blodkar og megle viktige funksjoner som inkluderer vedlikehold av fartøyets veggpermeabilitet, regulering av blodstrøm, blodplateaggregasjon og dannelse av nye blodkar. I hjernen er endotelceller en del av en kritisk blod-hjernebarriere som kontrollerer utveksling av materialer mellom hjernen og blodet¹. Våre studier i det siste tiåret har identifisert nye nevrogene roller i hjernen endotelceller som har betydelige implikasjoner for hjernens utvikling og atferd^2,3,4,5. Vi har vist at musen embryonale forebrain er vaskalisert av to forskjellige undertyper av fartøy, pial fartøy og periventrikulære fartøy, som varierer i anatomi, opprinnelse, og utviklingsprofil². Endotelceller som fôrer disse to fartøyundertypene viser tydelige forskjeller i genuttrykksprofilene sine. Mens pial endotelceller for det meste uttrykker gener relatert til betennelse og immunrespons, er periventrikulære endotelceller unikt beriket i uttrykk for gener som vanligvis er forbundet med nevrogenese, nevronal migrasjon, chemotaxis og axon veiledning³. Periventtrikulære endotelceller huser også en ny GABA-signalvei som er forskjellig fra den tradisjonelle nevronale GABA-signalveien⁵. Samtidig med genuttrykket ble periventrikulære endotelceller funnet å regulere migrasjon og distribusjon av GABAerge interneuroner i den utviklende neocortex. Under embryonisk utvikling gjennomgår periventrikulære endotelceller langdistansemigrasjon langs en ventral-dorsal gradient for å etablere det periventrikulære vaskulære nettverket^2,3. Denne trekkruten speiles en dag senere av interneuroner. Migrerende interneuroner samhandler fysisk med det forhåndsdannede periventrikulære vaskulære nettverket og bruker det som et styreskinne for å nå sitt endelige mål i neocortex. I tillegg til å fungere som et fysisk substrat, tjener periventulære endotelceller som kilden til navigasjonssignaler for migrerende nevroner. Periventtrikulær endotelcelleutskilles GABA guider interneuron migrasjon og regulerer deres endelige distribusjonsmønstre⁴. Defekter i interneuron migrasjon og distribusjon er forbundet med nevropsykiatriske lidelser som autisme, epilepsi, schizofreni og depresjon^6,7,8,9,10. Derfor blir studie av periventrikulære endotelcellefunksjoner og deres innflytelse på interneuronmigrasjon i menneskelig sammenheng avgjørende for å håndtere patogenesen av disse lidelsene.

Vi har generert humane periventrikulære-lignende endotelceller fra humane embryonale stamceller i vårt laboratorium¹¹, ved hjelp av indusert pluripotent stamcelle (iPSC) teknologi^12,13. For å validere om menneskelige periventrikulære endotelceller trofast etterligner mus periventtrikulær endotelceller, og for å kvantitativt vurdere deres innflytelse på interneuron migrasjon, utviklet vi tre in vitro analyser: en langdistanse migrasjon analyse, en co-kultur migrasjon analyse, og en kjemo-attraksjon analyse. Her beskriver vi protokoller for disse analysene i detalj. Alle tre analysene er basert på bruk av silikonkulturinnsatser for å skape en liten rektangulær cellelapp (av faste dimensjoner) omgitt av cellefri plass. Overføringsavstanden evalueres ved å måle avstanden mellom de endelige plasseringene til cellene fra kanten av det rektangulære plasteret som er skissert på dag 0. I langdistanse migrasjonsanalysen seedes humane periventrikulære endotelceller som en i midten av en 35 mm tallerken, og avstandene som kjøres av cellene over lang tid beregnes. I co-kultur migrasjon analysen, menneskelige periventrikulære endotelceller er co-seeded med menneskelige interneurons som en i en 35 mm tallerken. Dette oppsettet tillater undersøkelse av effekten av direkte fysiske interaksjoner av disse to celletypene på frekvensen av migrering av interneuroner. Den kjemo-attraksjon analysen måler migrasjon av interneurons som svar på kjemo-attraktive signaler utskilt av menneskelige periventtrikulære endotelceller. Interneurons er seeded som en rektangulær patch, med menneskelige periventtrikulære endotelceller og kontroll ikke-periventtrikulær endotelceller sådd som lignende størrelse flekker på hver side. Hver av cellepatchene er adskilt av et cellefritt gap på 500 μm. Respons av interneuroner vurderes ved å kvantifisere antall celler som har migrert mot periventrikulære endotelceller sammenlignet med kontroll av ikke-periventtrikulære endotelceller.

Disse analyser gir robust vurdering av menneskelige periventrikulære endotelcellefunksjoner og deres innflytelse på interneuronmigrasjon. Det nye oppsettet av langdistanseanalyse og co-kultur migrasjon analyse gir cellefri plass i området centimeter (~ 1-1,5 cm) for å tillate påvisning av langdistanse migrasjon. Et sammendrag av funksjonene i våre analyser sammenlignet med andre populære analyser presenteres i tabell 1. Samlet vil analysene som er beskrevet her tjene som en plattform for å vurdere “syke” periventrikulære endotelceller og interneuroner generert fra iPSCer av hjernesykdommer som schizofreni, autisme eller epilepsi. Disse analysene kan også brukes til å avgjøre hvordan ulike forhold (f.eks. hemmere, ligander, RNAi) påvirker cellemigrasjon. Til slutt kan disse analysene optimaliseres for andre celletyper for å måle langdistanseoverføring, kjemo-tiltrekning eller cellecellemediert migrering.

Protocol

1. Kultur og lagring av humane periventtrikulære endotelceller Vedlikehold humant periventtrikulær endotelceller på kjellermembranmatrisebelagt (se Materialtabell) 6-brønnplater i periventtrikulær endotelcellemedium (E6 medium som inneholder 50 ng/ml VEGF-A, 100 ng/ml FGF2 og 5 μM GABA) ved 37 °C og 5 % CO2. Bytt medium hver eneste dag. Tin kjellermembranmatrisen i 4 °C, og lag en 1:100-løsning ved å fortynne den i kaldt DMEM/F12 medium. Coat hver brønn av en 6-b…

Representative Results

Trinnene for å sette opp en en-brønns kulturinnsats inne i en 35 mm tallerken vises i figur 1. Langdistanse migrasjonsanalyse og co-kultur migrasjon analyse brukt en one-well innsats for å så ønsket antall celler i midten av en poly-L-ornithine / laminin belagt 35 mm parabolen. På dag 0 var cellene til stede som en rektangulær patch (Figur 2A,C). I dag 0 bilder, dagen 0 linjen kan lett identifiseres av den…

Discussion

Her beskrev vi tre in vitro-analyser som sammen gir kvantitativ vurdering av humane periventtrikulære endotelcellespesifikke egenskaper. Disse analyser vil være verdifulle i å få mekanistisk innsikt i samspillet mellom menneskelige periventtrikulære endotelceller med menneskelige interneuroner. Eksperimenter ved hjelp av ligander, inhibitorer eller celler med genspesifikk knockdown eller overexpression vil identifisere eller validere molekylære spillere som megler endothelial cellestyrt interneuron migrasjon eller …

Materials

Accutase dissociation solution	Millipore Sigma	SCR005	Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)
Anti-human β-Tubulin antibody	Biolegend	802001
Anti-human CD31 antibody	Millipore Sigma	CBL468
Anti- MAP2 antibody	Neuromics	CH22103
Anti-active Caspase 3 antibody	Millipore Sigma	AB3623
Control human endothelial cells	Cellular Dynamics	R1022
Control endothelial Cells Medium Supplement	Cellular Dynamics	M1019
Cryogenic vials	Fisher Scientific	03-337-7Y
DMEMF/12 medium	Thermofisher Scientific	11320033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
E6 medium	Thermofisher Scientific	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientific	PHG0261
Fibronectin	Thermofisher Scientific	33016-015
Freezing Container	Thermofisher Scientific	5100
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Hemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Human GABAergic neurons	Cellular Dynamics	R1013
Human GABAergic neurons base medium	Cellular Dynamics	M1010
Human GABAergic neuron Neural supplement	Cellular Dynamics	M1032
Laminin	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
Mounting Medium	Vector laboratories	H-1200
poly-L-ornithin	Sigma	p4957
PBS	Thermofisher Scientific	14190
Trypan blue	Thermofisher Scientific	15250061
TrypLE	Thermofisher Scientific	12563011	Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	Lifeline Cell Technologies	LL-0003	Component of control human endothelial cell medium
2-well silicone culture-Insert	ibidi	80209
3-well silicone culture-Insert	ibidi	80369
35 mm dish	Corning	430165
15-ml conical tube	Fisher Scientific	07-200-886
4% PFA solution	Fisher Scientific	AAJ19943K2
6-well tissue culture plate	Fisher Scientific	14-832-11
Inverted phase contrast microscope	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
Fluorescent microscope	Olympus	FSX-100