Migration, Chemo-Attraction och Co-Kultur Analyser för humanstamcells-härledda endotelceller och GABAergic nervceller

Summary

Vi presenterar tre enkla in vitro analyser-långväga migration analys, co-kultur migration analys, och chemo-attraktion analys-som kollektivt utvärdera funktionerna i mänskliga stamceller härrör periventricular endotel celler och deras interaktion med GABAergic interneurons.

Abstract

Roll hjärnan vaskulatur i nervsystemet utveckling och etiologi av hjärnsjukdomar blir alltmer få uppmärksamhet. Våra nyligen genomförda studier har identifierat en speciell population av vaskulära celler, periventricular endotel celler, som spelar en avgörande roll i migration och distribution av forebrain GABAergic interneurons under embryonal utveckling. Detta, tillsammans med deras cell-autonoma funktioner, anspelar på nya roller periventricular endotel celler i patologi neuropsykiatriska störningar som schizofreni, epilepsi och autism. Här har vi beskrivit tre olika in vitro-analyser som tillsammans utvärderar funktionerna i periventricular endotelceller och deras interaktion med GABAergic interneurons. Användning av dessa analyser, särskilt i ett mänskligt sammanhang, kommer att tillåta oss att identifiera sambandet mellan periventricular endotel celler och hjärnsjukdomar. Dessa analyser är enkla, billiga och reproducerbara, och kan enkelt anpassas till någon vidhäftande celltyp.

Introduction

Endotelceller bildar slemhinnan i blodkärlen och förmedlar viktiga funktioner som inkluderar underhåll av kärlväggpermeabilitet, reglering av blodflödet, trombocytaggregation en och bildandet av nya blodkärl. I hjärnan, endotelceller utgör en del av en kritisk blod -hjärnbarriär som tätt kontrollerar utbyte av material mellan hjärnan och blodomloppet¹. Våra studier under det senaste decenniet har identifierat nya neurogena roller hjärnan endotelceller som har betydande konsekvenser för hjärnans utveckling och beteende^2,3,4,5. Vi har visat att musenembryonala framhjärnan är vascularized av två olika subtyper av fartyg, pial fartyg och periventricular fartyg, som skiljer sig åt i anatomi, ursprung och utvecklingsmässiga profil². Endotelceller som kantar dessa två undertyper av kärl visar tydliga skillnader i deras genuttrycksprofiler. Medan pial endotelceller uttrycker mestadels gener relaterade till inflammation och immunsvar, periventricular endotel celler är unikt berikade i uttryck för gener som vanligen förknippas med neurogenes, neuronal migration, chemotaxis och axon vägledning³. Periventricular endotel celler också hus en ny GABA signalering väg som skiljer sig från den traditionella neuronala GABA signalering väg⁵. Samtidig t.ex. med dess genuttryck, periventricular endotel celler konstaterades reglera migration och distribution av GABAergic interneurons i utvecklings-neocortex. Under embryonal utveckling genomgår periventricular endotelceller långväga migration längs en ventral-rygglutning för att fastställa det periventricular vaskulära nätverket^2,3. Denna migrationsväg speglas en dag senare av interneurons. Migrera interneurons interagerar fysiskt med det förbildade periventricular vaskulära nätverket och använda det som en guiderail för att nå sin slutdestination i neocortex. Förutom att fungera som ett fysiskt substrat, periventricular endotel celler fungera som källan till navigationssignaler för migrerande nervceller. Periventricular endotel cell-utsöndras GABA guider interneuron migration och reglerar deras slutliga distributionsmönster⁴. Defekter i interneuron migration och distribution är förknippade med neuropsykiatriska störningar såsom autism, epilepsi, schizofreni och depression^6,7,8,9,10. Därför blir studier av periventricular endotel cell funktioner och deras inverkan på interneuron migration i mänskligt sammanhang kritisk för att ta itu med patogenesen vid dessa sjukdomar.

Vi har genererat mänskliga periventricular-liknande endotelceller från mänskliga embryonala stamceller i vårt laboratorium^11,med inducerad pluripotent stamceller (iPSC) teknik^12,13. För att validera om mänskliga periventricular endotel celler troget efterlikna mus periventricular endotel celler, och att kvantitativt bedöma deras inflytande på interneuron migration, utvecklade vi tre in vitro analyser: en långväga migration analys, en co-kultur migration analys, och en chemo-attraktion analys. Här beskriver vi protokoll för dessa analyser i detalj. Alla tre analyser är baserade på användningen av silikon kultur skär för att skapa en liten rektangulär fläck av celler (av fasta dimensioner) omgiven av cellfritt utrymme. Migreringsavstånd utvärderas genom att mäta avståndet mellan cellernas slutliga positioner från gränsen till den rektangulära patchsom har beskrivits dag 0. I långväga migration analys, mänskliga periventricular endotel celler är sådd som en patch i mitten av en 35 mm skålen, och de avstånd som färdas av cellerna över en lång tid beräknas. I co-kultur migration analys, mänskliga periventricular endotel celler är samseedade med mänskliga interneurons som en lapp i en 35 mm skålen. Denna inställning möjliggör undersökning av effekten av direkta fysiska interaktioner av dessa två celltyper på graden av migration av interneurons. Chemo-attraktion analysen mäter migration av interneurons som svar på kemo-attraktiva signaler utsöndras av mänskliga periventricular endotel celler. Interneurons är sådd som en rektangulär patch, med mänskliga periventricular endotel celler och kontroll icke-periventricular endotel celler sådd som liknande storlek fläckar på vardera sidan. Var och en av cellplåstren separeras av en cellfri lucka på 500 μm. Svar av interneurons bedöms genom att kvantifiera antalet celler som har migrerat till periventricular endotelceller jämfört med kontroll icke-periventricular endotelceller.

Dessa analyser ger robust bedömning av mänskliga periventricular endotel cell funktioner och deras inflytande på interneuron migration. Den nya installationen av långväga analys och co-kultur migration analys ger cellfritt utrymme i intervallet centimeter (~ 1-1,5 cm) för att möjliggöra upptäckt av långväga migration. En sammanfattning av funktionerna i våra analyser jämfört med andra populära analyser presenteras i tabell 1. Kollektivt, de analyser som beskrivs här kommer att fungera som en plattform för att bedöma “sjuka” periventricular endotel celler och interneurons genereras från iPSCs av hjärnsjukdomar som schizofreni, autism eller epilepsi. Dessa analyser kan också användas för att avgöra hur olika tillstånd (t.ex. hämmare, ligander, RNAi) påverkar cellmigrationen. Slutligen kan dessa analyser optimeras för andra celltyper för att mäta långväga migration, kemo-attraktion eller cell-cell medierad migration.

Protocol

1. Kultur och lagring av mänskliga periventricular endotelceller Håll humana periventricular endotelceller på matrisbelagda källaren membran (se Materialförteckning)6-brunnsplattor i periventricular endotelcellmedium (E6 medium som innehåller 50 ng/ml VEGF-A, 100 ng/ml FGF2 och 5 μM GABA) vid 37 °C och 5% CO2. Byt medium varje annan dag. Tina källaren membran matris i 4 °C, och gör en 1:100 lösning genom att späda ut den i kallt DMEM/F12 medium. Coat varje brun…

Representative Results

Stegen för att sätta upp en enbrunnskulturinsats inuti en 35 mm-maträtt visas i figur 1. Långväga migration analys och co-kultur migration analys används en enbrunnsinsats för att så utsäde önskat antal celler i mitten av en poly-L-ornitin / laminin belagd 35 mm skålen. Dag 0 var cellerna närvarande som en rektangulär patch (figur 2A,C). I dag 0-bilder kan dag 0-linjen lätt identifieras av cellskikt…

Discussion

Här beskrev vi tre in vitro-analyser som tillsammans ger kvantitativ bedömning av mänskliga periventricular endotel cell-specifika egenskaper. Dessa analyser kommer att vara värdefulla för att få mekanistiska insikter i samspelet mellan mänskliga periventricular endotel celler med mänskliga interneurons. Experiment med ligand, inhibitorer eller celler med genspecifik knockdown eller överuttryck kommer att identifiera eller validera molekylära aktörer som medla endotel cell-guidad interneuron migration eller l?…

Materials

Accutase dissociation solution	Millipore Sigma	SCR005	Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)
Anti-human β-Tubulin antibody	Biolegend	802001
Anti-human CD31 antibody	Millipore Sigma	CBL468
Anti- MAP2 antibody	Neuromics	CH22103
Anti-active Caspase 3 antibody	Millipore Sigma	AB3623
Control human endothelial cells	Cellular Dynamics	R1022
Control endothelial Cells Medium Supplement	Cellular Dynamics	M1019
Cryogenic vials	Fisher Scientific	03-337-7Y
DMEMF/12 medium	Thermofisher Scientific	11320033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
E6 medium	Thermofisher Scientific	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientific	PHG0261
Fibronectin	Thermofisher Scientific	33016-015
Freezing Container	Thermofisher Scientific	5100
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Hemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Human GABAergic neurons	Cellular Dynamics	R1013
Human GABAergic neurons base medium	Cellular Dynamics	M1010
Human GABAergic neuron Neural supplement	Cellular Dynamics	M1032
Laminin	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
Mounting Medium	Vector laboratories	H-1200
poly-L-ornithin	Sigma	p4957
PBS	Thermofisher Scientific	14190
Trypan blue	Thermofisher Scientific	15250061
TrypLE	Thermofisher Scientific	12563011	Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	Lifeline Cell Technologies	LL-0003	Component of control human endothelial cell medium
2-well silicone culture-Insert	ibidi	80209
3-well silicone culture-Insert	ibidi	80369
35 mm dish	Corning	430165
15-ml conical tube	Fisher Scientific	07-200-886
4% PFA solution	Fisher Scientific	AAJ19943K2
6-well tissue culture plate	Fisher Scientific	14-832-11
Inverted phase contrast microscope	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
Fluorescent microscope	Olympus	FSX-100