تحويل جذر الطماطم متبوعاً بالتلقيح مع Ralstonia Solanacearum للتحليل الوراثي المباشر لمرض الذبول البكتيري
Summary
هنا ، نقدم طريقة متعددة الاستخدامات لتحويل جذر الطماطم تليها التطعيم مع Ralstonia solanacearum لإجراء تحليل وراثي مباشر لدراسة مرض الذبول البكتيري.
Abstract
Ralstonia solanacearum هو التربة المدمرة التي تحملها مسببات الأمراض الوعائية التي يمكن أن تصيب مجموعة كبيرة من الأنواع النباتية، مما تسبب تهديدا هاما للزراعة. ومع ذلك ، فإن نموذج Ralstonia غير مستكشف إلى حد كبير بالمقارنة مع النماذج الأخرى التي تنطوي على مسببات الأمراض النباتية البكتيرية ، مثل Pseudomonas syringae في أرابيدوبسيس. البحوث التي تستهدف فهم التفاعل بين Ralstonia ونباتات المحاصيل أمر ضروري لتطوير حلول مستدامة لمكافحة مرض الذبول البكتيري ولكن يعوقها حاليا عدم وجود اختبارات تجريبية مباشرة لتوصيف المكونات المختلفة للتفاعل في النباتات المضيفة الأصلية. في هذا السيناريو، قمنا بتطوير طريقة لإجراء التحليل الجيني للعدوى Ralstonia من الطماطم، مضيف طبيعي من Ralstonia. وتستند هذه الطريقة على Agrobacterium rhizogenesبوساطة التحول من جذور الطماطم، تليها تطعيم Ralstonia التربة منقوع من النباتات الناتجة، التي تحتوي على جذور متحولة التعبير عن بناء الفائدة. براعة من تحليل تحويل الجذر يسمح أداء إما الإفراط في التعبير الجيني أو الجين إسكات بوساطة RNAi. كدليل على المفهوم، استخدمنا هذه الطريقة لإظهار أن إسكات RNAi بوساطة SlCESA6 في جذور الطماطم منح المقاومة لRalstonia. هنا ، نصف هذه الطريقة بالتفصيل ، مما يتيح النهج الوراثية لفهم مرض الذبول البكتيري في وقت قصير نسبيًا ومع متطلبات صغيرة من المعدات ومساحة نمو النباتات.
Introduction
Ralstonia solanacearum، العامل السببي لمرض الذبول البكتيري ، هو ممرض الأوعية الدموية المدمرة التي تنتقل عن طريق التربة مع توزيع عالمي يمكن أن تصيب مجموعة كبيرة من أنواع النباتات ، بما في ذلك البطاطا والطماطم والتبغ والموز والفلفل والباذنجان ، من بين أمور أخرى1،2. خسائر الغلة الناجمة عن Ralstonia يمكن أن تصل إلى 80-90٪ من الإنتاج في الطماطم والبطاطا أو الموز، اعتمادا على الأصناف والمناخ والتربة وغيرها من العوامل3. ومع ذلك ، فإن نموذج Ralstonia غير مستكشف إلى حد كبير بالمقارنة مع النماذج الأخرى التي تنطوي على مسببات الأمراض النباتية البكتيرية ، مثل Pseudomonas syringae أو Xanthomonas spp. بالإضافة إلى ذلك ، تركز معظم الدراسات في التفاعلات النباتية والميكروبات على نموذج النبات Arabidopsis thaliana. على الرغم من أن الأبحاث التي تستخدم هذه النماذج قد ساهمت إلى حد كبير في فهمنا للتفاعلات النباتية والبكتيريا ، إلا أنها لا تعالج الضرورة الحالية لفهم هذه التفاعلات في نباتات المحاصيل. البحوث التي تستهدف فهم التفاعل بين Ralstonia ونباتات المحاصيل أمر ضروري لتطوير حلول مستدامة لمكافحة مرض الذبول البكتيري ولكن يعوقها حاليا عدم وجود اختبارات تجريبية مباشرة لتوصيف المكونات المختلفة للتفاعل. على وجه الخصوص ، الطماطم ، مضيف طبيعي لRalstonia، هو ثاني أهم محصول نباتي في جميع أنحاء العالم ويتأثر بعدد كبير من الأمراض4، بما في ذلك مرض الذبول البكتيري. في هذا العمل، قمنا بتطوير طريقة سهلة لإجراء التحليل الجيني لعدوى رالستونيا من الطماطم. ويستند هذا الأسلوب على Agrobacterium rhizogenesبوساطة التحول من جذور الطماطم، وذلك باستخدام DsRed fluorescence كعلامة الاختيار5، تليها تطعيم Ralstonia التربة منقوع من النباتات الناتجة، التي تحتوي على جذور متحولة التعبير عن بناء الفائدة. براعة من تحليل تحويل الجذر يسمح أداء إما الإفراط في التعبير الجيني أو الجين إسكات بوساطة RNAi.
ويتمثل أحد القيود المحتملة لهذه الطريقة في النمو المتبقي للجذور غير المتحولة. هذا مهم بشكل خاص في الحالات التي يفتقر فيها البلازميد المستخدم إلى جين مراسل يسمح باختيار الجذور المتحولة. ولحل هذه المشكلة، قمنا بتطوير طريقة بديلة تعتمد على اختيار المضادات الحيوية، والتي تمنع نمو الجذور غير المتحولة مع السماح بنمو الجذور المتحولة المقاومة للمضادات الحيوية. نظرًا لأن A. rhizogenes لا تحفز على تحويل البراعم ، فهي عرضة للمضادات الحيوية ، وبالتالي ، يجب أن تبقى منفصلة عن الوسط المحتوي على المضادات الحيوية.
على الرغم من أن مقاومة النبات ضد Ralstonia ليست مفهومة جيدا، وقد ارتبطت العديد من التقارير تعديلات جدار الخلية لتعزيز المقاومة للذبول البكتيري6،,7،,8،,9. وقد اقترح أن هذه التعديلات جدار الخلية تؤثر على تطور الأوعية الدموية، وهو جانب أساسي لنمط حياة Ralstonia داخل النبات10. وقد ثبت الطفرات في الجينات ترميز synthases السليلوز CESA4، CESA7 وCESA8 في Arabidopsis thaliana لإضعاف سلامة جدار الخلية الثانوية ، مما تسبب في تعزيز المقاومة لRalstonia، والتي يبدو أن ترتبط ABA الإشارات8. لذلك ، كدليل على مفهوم طريقتنا ، قمنا بإجراء إسكات الجينات بوساطة RNAi من SlCESA6 (Solyc02g072240)، وهو خلية جدار ثانوي cellulosease ، وتقويم العظام من AtCESA8 (At4g18780). أظهرت التطعيمات اللاحقة التي تغمر التربة مع Ralstonia أن إسكات SlCESA6 عزز المقاومة لأعراض الذبول البكتيري ، مما يشير إلى أن المقاومة بوساطة جدار الخلية لRalstonia من المرجح أن يتم الحفاظ عليها في الطماطم ، والتحقق من صحة طريقتنا لإجراء التحليل الوراثي لمقاومة الذبول البكتيري في جذور الطماطم. هنا ، نصف هذه الطريقة بالتفصيل ، مما يتيح النهج الوراثية لفهم مرض الذبول البكتيري في وقت قصير نسبيًا ومع متطلبات صغيرة من المعدات ومساحة نمو النباتات.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ralstonia solanacearum يشكل تهديدا هاما للزراعة; ومع ذلك ، فإن تفاعلها مع المضيفين الطبيعيين ذوي الأهمية الزراعية لا يزال غير مفهوم جيد ًا مقارنة بمسببات الأمراض البكتيرية الأخرى ، خاصة في أنواع النباتات الزراعية. وفي معظم الحالات، يعوق الوقت والنفقات اللازمة لتعديل النباتات المضيفة وراثيا ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر جميع أعضاء مختبر ماتشو على المناقشات المفيدة، وألفارو لوبيز – غارسيا على المشورة الإحصائية، وسينيو جيان على المساعدة التقنية والإدارية خلال هذا العمل. نشكر PSC الخلية البيولوجيا مرفق الأساسية للمساعدة في التصوير الفلوري ة تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للأكاديمية الصينية للعلوم (منحة XDB27040204), مركز شنغهاي لبيولوجيا الإجهاد النباتي (الصينية أكاديمية العلوم) وبرنامج المواهب الصينية 1000.
Materials
| 90 mm square Petri-dishes | |||
| Agar powder | Sigma-Aldrich | ||
| Bacto peptone | BD (Becton and Dickinson) | ||
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | ||
| Filter paper | |||
| In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985 | Berthold Technologies | ||
| Jiffy pots | Jiffy Products International A.S. | ||
| Micropore tape | 3M | ||
| Murashige and Skoog medium (M519) | Phytotechlab | ||
| Pindstrup substrate | Pindstrup Mosebrug A/S | ||
| Scalpel and blade | |||
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | ||
| Sterile clean bench | |||
| Tweezers | |||
| Wahtman paper | Wahtman International Ltd. Maldstone | ||
| Yeast extract | OXOID |
References
- Jiang, G., et al. Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives. Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549 (2017).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Elphinstone, J. G., Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. . The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. , 9-28 (2005).
- Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. . Compendium of Tomato 1094 Diseases. , (1991).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Wydra, K., Beri, H. Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).
- Wydra, K., Beri, H. Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).
- Hernández-Blanco, C., et al. Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance. Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).
- Denancé, N., et al. Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism. Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).
- Digonnet, C., et al. Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall. Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).
- Sang, Y., et al. The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).
- Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts. New Phytologist. 192, 976-987 (2011).
- Wang, K., et al. Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum. Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- León-Morcillo, R. J., Martín-Rodríguez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling. Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).
- Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. Retire statistical significance. Nature. 567, 305-307 (2019).
