שורש עגבניות המרה ואחריו חיסונים עם Ralstonia Solanacearum ניתוח גנטי פשוט של מחלת וילט חיידקי
Summary
כאן, אנו מציגים שיטה רב-תכליתית לשינוי בשורש העגבניות ולאחריה החיסון לביצוע ניתוח גנטי פשוט לחקר מחלות וילט בקטריאלי.
Abstract
Ralstonia solanacearum היא אדמה הרסנית הנישאים פתוגן כלי דם שיכולים להדביק מגוון רחב של מינים צמח, גורם איום חשוב על החקלאות. עם זאת, מודל Ralstonia הוא באופן משמעותי בהשוואה למודלים אחרים מעורבים פתוגנים צמח חיידקי, כגון פסאודומונס Syringae ב arabidopsis. מחקר ממוקד כדי להבין את האינטראקציה בין Ralstonia וצמחים יבול חיוני לפתח פתרונות קיימא להילחם נגד מחלת וילט חיידקי אבל מפריע כיום על ידי חוסר הניסיוני הנסיוני הפשוט לאפיין את המרכיבים השונים של האינטראקציה צמחים מארחים יליד. בתרחיש זה, פיתחנו שיטה לבצע ניתוח גנטי של זיהום Ralstonia של עגבניה, שורה טבעית של ralstonia. שיטה זו מבוססת על Agrobacteriumמתווכת הטרנספורמציה של שורשי עגבניות, ואחריו ralstonia קרקע-drenching החיסון של הצמחים כתוצאה מכך, המכיל שורשים שהפכו המבטא את המבנה של עניין. הרב-תכליתיות של השינוי הבסיסי מאפשר ביצוע או ביטוי היתר גנטית או גנים השתקה על ידי RNAi. כהוכחה למושג, השתמשנו בשיטה זו כדי להראות כי RNAi-תיווך השתקה של SlCESA6 בשורשי עגבניות הענקת עמידות לראסטוניה. כאן, אנו מתארים את השיטה הזאת בפרוטרוט, המאפשר גישות גנטיות להבין מחלות וילט חיידקי בזמן קצר יחסית, עם דרישות קטנות של ציוד ומרחב הצמיחה צמח.
Introduction
Ralstonia solanacearum, הסוכן הסיבתי של מחלת וילט חיידקי, היא קרקע הרסנית הנגרמת פתוגן כלי דם עם התפלגות עולמית שיכולה להדביק מגוון רחב של מינים צמח, כולל תפוחי אדמה, עגבניות, טבק, בננה, פלפל וחציל, בין השאר1,2. תשואה הפסדים שנגרמו על ידי Ralstonia יכול להגיע 80-90% של הייצור עגבניות, תפוחי אדמה או בננה, בהתאם זנים, אקלים, אדמה וגורמים אחרים3. עם זאת, מודל Ralstonia הוא באופן משמעותי בהשוואה למודלים אחרים מעורבים פתוגנים צמח חיידקי, כגון פסאודומונס syringae או קסטומונס spp. בנוסף, רוב המחקרים באינטראקציות הצמח-חיידק מתמקדים צמח המודל Arabidopsis thaliana. למרות שמחקרים המשתמשים במודלים אלה תרמו במידה רבה להבנת האינטראקציות של הצמחים-חיידקים, הם אינם מטפלים בצורך הנוכחי להבנת האינטראקציות הללו בצמחי היבול. מחקר ממוקד להבנת האינטראקציה בין Ralstonia וצמחים יבול חיוני כדי לפתח פתרונות קיימא להילחם נגד מחלת וילט חיידקי אבל מפריע כיום על ידי חוסר הניסיוני הנסיוני הישיר לאפיין את הרכיבים השונים של האינטראקציה. במיוחד, עגבניה, מארח טבעי עבור Ralstonia, הוא יבול הירקות השני החשוב ביותר ברחבי העולם והוא מושפע שפע של מחלות4, כולל מחלת וילט חיידקי. בעבודה זו, פיתחנו שיטה קלה לבצע ניתוח גנטי של זיהום Ralstonia של עגבניה. שיטה זו מבוססת על Agrobacteriumמתווכת הטרנספורמציה של שורשי עגבניות, באמצעות הפלואורסצנטית dsred כסמן בחירה5, ואחריו ralstonia קרקע-drenching של הצמחים וכתוצאה מכך, המכיל שורשים שהפכו לבטא את המבנה של עניין. הרב-תכליתיות של השינוי הבסיסי מאפשר ביצוע או ביטוי היתר גנטית או גנים השתקה על ידי RNAi.
מגבלה פוטנציאלית של שיטה זו מורכבת מגידול שיורית של שורשים שאינם משתנים. זה חשוב במיוחד במקרים שבהם השתמשו בפלסטלינה חסר גן עיתונאי המאפשר את הבחירה של שורשים שהפכו. כדי לפתור בעיה זו, פיתחנו שיטה חלופית המבוססת על בחירה אנטיביוטית, אשר מעכב את הצמיחה של שורשים שאינם משתנים תוך מתן אפשרות לצמיחה של שורשים בריאים עמידים לאנטיביוטיקה השתנה. מאז ה -ריזוזוגנים לא מזרז את הטרנספורמציה של נצרי, הם רגישים לאנטיביוטיקה, ולכן הם צריכים להיות מופרדים ממדיום המכיל אנטיביוטיקה.
למרות התנגדות הצמח נגד ralstonia אינו מובן היטב, דיווחים מספר יש הקשורים קיר תא שינויים התנגדות משופרת חיידקיםוילט 6,7,8,9.6 הוצע כי אלה שינויים קיר התא משפיעים על פיתוח כלי דם, היבט חיוני לאורח החיים של Ralstonia בתוך הצמח10. מוטציות בגנים קידוד התאית סטנדרטים CESA4, CESA7 ו CESA8 ב arabidopsis thaliana הוכחו לפגוע שלמות הקיר התא המשני, גרימת עמידות משופרת RALSTONIA, אשר נראה קשור ל-ABA איתות8. לכן, כהוכחה למושג של השיטה שלנו, ביצעת גן RNAi-תיווך השתקה של SlCESA6 (Solyc02g072240), תא משני הקיר תאית סטנדרטים, ו אורתולוג של AtCESA8 (At4g18780). בעקבות הקרקע-drenching החיסון עם Ralstonia הראה כי השתקה SlCESA6 התנגדות משופרת לתסמינים וילט בקטריאלי, הרומז כי התא התנגדות מתווכת כדי ralstonia סביר להניח בעגבניה, ולאמת את השיטה שלנו כדי לבצע ניתוח גנטי של התנגדות וילט חיידקי בשורשי עגבניות. כאן, אנו מתארים את השיטה הזאת בפרוטרוט, המאפשר גישות גנטיות להבין מחלות וילט חיידקי בזמן קצר יחסית, עם דרישות קטנות של ציוד ומרחב הצמיחה צמח.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ralstonia סולאליום מהווה איום חשוב לחקלאות; עם זאת, האינטראקציה שלה עם המארחים הטבעי של החשיבות החקלאית הוא עדיין הבין באופן גרוע לעומת פתוגנים חיידקיים אחרים, במיוחד בגידולים מינים צמח. ברוב המקרים, ניתוח גנטי מפריע הזמן וההוצאות הדרושות כדי לשנות גנטית צמחים מארחים. כדי לטפל בבעיה זו ול…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לכל חברי המעבדה של המעבדה המאצ לדיונים מועילים, אלווארו לופז-גרסיה לייעוץ סטטיסטי, ולקסיג’יו ג’יאן לסיוע טכני ומנהלי במהלך עבודה זו. אנו מודים PSC Cell ביולוגיה מתקן הליבה לסיוע עם הדמיה פלואורסצנטית עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית מחקר עדיפות אסטרטגית של האקדמיה הסינית למדעים (גרנט XDB27040204), מרכז שנגחאי עבור ביולוגיה לחץ הצמח (סינית האקדמיה למדעים ותוכנית הכשרונות הסינית 1000.
Materials
| 90 mm square Petri-dishes | |||
| Agar powder | Sigma-Aldrich | ||
| Bacto peptone | BD (Becton and Dickinson) | ||
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | ||
| Filter paper | |||
| In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985 | Berthold Technologies | ||
| Jiffy pots | Jiffy Products International A.S. | ||
| Micropore tape | 3M | ||
| Murashige and Skoog medium (M519) | Phytotechlab | ||
| Pindstrup substrate | Pindstrup Mosebrug A/S | ||
| Scalpel and blade | |||
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | ||
| Sterile clean bench | |||
| Tweezers | |||
| Wahtman paper | Wahtman International Ltd. Maldstone | ||
| Yeast extract | OXOID |
References
- Jiang, G., et al. Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives. Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549 (2017).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Elphinstone, J. G., Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. . The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. , 9-28 (2005).
- Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. . Compendium of Tomato 1094 Diseases. , (1991).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Wydra, K., Beri, H. Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).
- Wydra, K., Beri, H. Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).
- Hernández-Blanco, C., et al. Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance. Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).
- Denancé, N., et al. Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism. Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).
- Digonnet, C., et al. Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall. Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).
- Sang, Y., et al. The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).
- Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts. New Phytologist. 192, 976-987 (2011).
- Wang, K., et al. Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum. Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- León-Morcillo, R. J., Martín-Rodríguez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling. Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).
- Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. Retire statistical significance. Nature. 567, 305-307 (2019).
