Tomato Root Transformatie gevolgd door inenting met Ralstonia Solanacearum voor eenvoudige genetische analyse van bacteriële wilt ziekte
Summary
Hier presenteren we een veelzijdige methode voor tomatenworteltransformatie, gevolgd door inenting met Ralstonia solanacearum om eenvoudige genetische analyse uit te voeren voor de studie van bacteriële verwelkingsziekte.
Abstract
Ralstonia solanacearum is een verwoestende bodem gedragen vasculaire ziekteverwekker die een groot scala van plantensoorten kan infecteren, waardoor een belangrijke bedreiging voor de landbouw. Echter, de Ralstonia model is aanzienlijk onderonderzocht in vergelijking met andere modellen met bacteriële plantenpathogenen, zoals Pseudomonas syringae in Arabidopsis. Onderzoek gericht op het begrijpen van de interactie tussen Ralstonia en gewasplanten is essentieel voor het ontwikkelen van duurzame oplossingen voor de bestrijding van bacteriële verwelkingziekte, maar wordt momenteel belemmerd door het ontbreken van eenvoudige experimentele testen om de verschillende componenten van de interactie in inheemse waardplanten te karakteriseren. In dit scenario hebben we een methode ontwikkeld om genetische analyse van Ralstonia-infectie van tomaat uit te voeren, een natuurlijke gastheer van Ralstonia. Deze methode is gebaseerd op Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie van tomatenwortels, gevolgd door Ralstonia bodem-drenken van de resulterende planten, met getransformeerde wortels die de constructie van belang uitdrukken. De veelzijdigheid van de root transformatie test maakt het mogelijk het uitvoeren van ofwel gen overexpressie of gen uitschakeling bemiddeld door RNAi. Als een proof of concept, gebruikten we deze methode om aan te tonen dat RNAi-gemedieerde uitschakeling van SlCESA6 in tomatenwortels de weerstand tegen Ralstoniaverleende. Hier beschrijven we deze methode in detail, waardoor genetische benaderingen om bacteriële verwelkingziekte te begrijpen in een relatief korte tijd en met kleine eisen van apparatuur en plant groeiruimte.
Introduction
Ralstonia solanacearum, het oorzakelijk middel van bacteriële verwelkingsziekte, is een verwoestende bodem gedragen vasculaire ziekteverwekker met een wereldwijde distributie die een groot scala van plantensoorten kan infecteren, waaronder aardappel, tomaat, tabak, banaan, peper en aubergine, onder andere1,2. Opbrengstverliezen veroorzaakt door Ralstonia kunnen 80-90% van de productie in tomaat, aardappel of banaan bereiken, afhankelijk van cultivar, klimaat, bodem en andere factoren3. Echter, de Ralstonia model is aanzienlijk onderonderzocht in vergelijking met andere modellen met bacteriële plantenpathogenen, zoals Pseudomonas syringae of Xanthomonas spp. Bovendien zijn de meeste studies in plantenmicrobe interacties gericht op de modelplant Arabidopsis thaliana. Hoewel onderzoek met behulp van deze modellen grotendeels heeft bijgedragen aan ons begrip van planten-bacteriën interacties, ze niet ingaan op de huidige noodzaak om deze interacties in gewasplanten te begrijpen. Onderzoek gericht op het begrijpen van de interactie tussen Ralstonia en gewasplanten is essentieel voor het ontwikkelen van duurzame oplossingen voor de bestrijding van bacteriële verwelkingziekte, maar wordt momenteel belemmerd door het ontbreken van eenvoudige experimentele testen om de verschillende componenten van de interactie te karakteriseren. In het bijzonder, tomaat, een natuurlijke gastheer voor Ralstonia, is de tweede belangrijkste groentegewas wereldwijd en wordt beïnvloed door een overvloed aan ziekten4, met inbegrip van bacteriële verwelking ziekte. In dit werk hebben we een eenvoudige methode ontwikkeld om genetische analyse van Ralstonia-infectie van tomaat uit te voeren. Deze methode is gebaseerd op Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie van tomatenwortels, met behulp van DsRed fluorescentie als selectiemarker5, gevolgd door Ralstonia bodem-drenken van de resulterende planten, met getransformeerde wortels die de constructie van belang uitdrukken. De veelzijdigheid van de root transformatie test maakt het mogelijk het uitvoeren van ofwel gen overexpressie of gen uitschakeling bemiddeld door RNAi.
Een mogelijke beperking van deze methode bestaat uit de restgroei van niet-getransformeerde wortels. Dit is vooral belangrijk in de gevallen waarin de gebruikte plasmid een reportergen mist dat de selectie van getransformeerde wortels mogelijk maakt. Om dit probleem op te lossen, hebben we een alternatieve methode ontwikkeld op basis van antibioticaselectie, die de groei van niet-getransformeerde wortels remt en tegelijkertijd de groei van gezonde antibioticaresistente getransformeerde wortels mogelijk maakt. Aangezien A. rhizogenes de transformatie van scheuten niet induceert, zijn ze vatbaar voor het antibioticum en moeten ze daarom gescheiden worden gehouden van het antibioticahoudende medium.
Hoewel de weerstand van planten tegen Ralstonia niet goed wordt begrepen, hebben verschillende rapporten celwandwijzigingen geassocieerd met een verbeterde weerstand tegen bacteriële verwelking6,7,8,9. Er is gesuggereerd dat deze celwandveranderingen de vasculaire ontwikkeling beïnvloeden, een essentieel aspect voor de levensstijl van Ralstonia in de plant10. Mutaties in genen die de cellulose synthases CESA4, CESA7 en CESA8 in Arabidopsis thaliana coderen, zijn aangetoond dat secundaire celwand integriteit schaden, waardoor een verbeterde weerstand tegen Ralstonia, die lijkt te zijn gekoppeld aan ABA signalering8. Daarom hebben we als proof of concept voor onze methode RNAi-gemedieerde genuitschakeling van SlCESA6 (Solyc02g072240), een secundaire celwandcellulose synthase en ortholog van AtCESA8 (At4g18780) uitgevoerd. Latere bodem-drenken inenting met Ralstonia bleek dat het uitschakelen van SlCESA6 verbeterde weerstand tegen bacteriële wilt symptomen, wat suggereert dat cel wandgemedieerde weerstand tegen Ralstonia is waarschijnlijk bewaard in tomaat, en valideren van onze methode uit te voeren genetische analyse van bacteriële wilt resistentie in wortels tomaat. Hier beschrijven we deze methode in detail, waardoor genetische benaderingen om bacteriële verwelkingziekte te begrijpen in een relatief korte tijd en met kleine eisen van apparatuur en plant groeiruimte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ralstonia solanacearum vormt een belangrijke bedreiging voor de landbouw; echter, de interactie met natuurlijke gastheren van agrarisch belang is nog steeds slecht begrepen in vergelijking met andere bacteriële pathogenen, vooral in gewasplantensoorten. In de meeste gevallen wordt genetische analyse belemmerd door de tijd en kosten die nodig zijn om waardplanten genetisch te modificeren. Om dit probleem aan te pakken en de genetische analyse van R. solanacearum-infectie bij tomaat te vergemakkelijken, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken alle lableden van het Macho laboratorium voor nuttige discussies, Alvaro López-García voor statistisch advies, en Xinyu Jian voor technische en administratieve bijstand tijdens dit werk. Wij danken de PSC Cell Biology kernfaciliteit voor hulp bij fluorescentie beeldvorming Dit werk werd ondersteund door het Strategic Priority Research Program van de Chinese Academie van Wetenschappen (subsidie XDB27040204), het Shanghai Center for Plant Stress Biology (Chinees Academy of Sciences) en het Chinese 1000 Talents programma.
Materials
| 90 mm square Petri-dishes | |||
| Agar powder | Sigma-Aldrich | ||
| Bacto peptone | BD (Becton and Dickinson) | ||
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | ||
| Filter paper | |||
| In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985 | Berthold Technologies | ||
| Jiffy pots | Jiffy Products International A.S. | ||
| Micropore tape | 3M | ||
| Murashige and Skoog medium (M519) | Phytotechlab | ||
| Pindstrup substrate | Pindstrup Mosebrug A/S | ||
| Scalpel and blade | |||
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | ||
| Sterile clean bench | |||
| Tweezers | |||
| Wahtman paper | Wahtman International Ltd. Maldstone | ||
| Yeast extract | OXOID |
References
- Jiang, G., et al. Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives. Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549 (2017).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Elphinstone, J. G., Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. . The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. , 9-28 (2005).
- Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. . Compendium of Tomato 1094 Diseases. , (1991).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Wydra, K., Beri, H. Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).
- Wydra, K., Beri, H. Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).
- Hernández-Blanco, C., et al. Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance. Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).
- Denancé, N., et al. Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism. Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).
- Digonnet, C., et al. Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall. Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).
- Sang, Y., et al. The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).
- Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts. New Phytologist. 192, 976-987 (2011).
- Wang, K., et al. Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum. Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- León-Morcillo, R. J., Martín-Rodríguez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling. Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).
- Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. Retire statistical significance. Nature. 567, 305-307 (2019).
