Tomat rotomvandling följt av inokulering med Ralstonia Solanacearum för enkel genetisk analys av bakteriell vissna sjukdom
Summary
Här presenterar vi en mångsidig metod för tomatrotomvandling följt av inokulering med Ralstonia solanacearum för att utföra enkel genetisk analys för studier av bakteriell vissnande sjukdom.
Abstract
Ralstonia solanacearum är en förödande jordburen vaskulär patogen som kan infektera ett stort spektrum av växtarter, vilket orsakar ett viktigt hot mot jordbruket. Emellertid, Ralstonia modellen är betydligt underutforskad i jämförelse med andra modeller som involverar bakteriella växtpatogener, såsom Pseudomonas syringae i Arabidopsis. Forskning som syftar till att förstå samspelet mellan Ralstonia och växtväxter är viktigt att utveckla hållbara lösningar för att bekämpa bakteriell vissnande sjukdom, men för närvarande hindras av bristen på enkla experimentella analyser för att karakterisera de olika komponenterna i interaktionen i inhemska värdväxter. I detta scenario har vi utvecklat en metod för att utföra genetisk analys av Ralstonia infektion av tomat, en naturlig mängd Ralstonia. Denna metod är baserad på Agrobacterium rhizogenes-medieradomvandling av tomatrötter, följt av Ralstonia jord-dränkande inokulering av de resulterande växterna, som innehåller förvandlade rötter som uttrycker byggandet av intresse. Mångsidigheten hos rotomvandlingsanalysen gör det möjligt att utföra antingen genöveruttryck eller genljuddämpning medhjälp av RNAi. Som ett proof of concept, använde vi denna metod för att visa att RNAi-medierad tystas av SlCESA6 i tomat rötter tilldelas motstånd mot Ralstonia. Här beskriver vi denna metod i detalj, vilket gör det möjligt för genetiska metoder att förstå bakteriell vissna sjukdom på relativt kort tid och med små krav på utrustning och växttillväxtutrymme.
Introduction
Ralstonia solanacearum, orsaksmedlet för bakteriell vissnande sjukdom, är en förödande jordburen vaskulär patogen med en världsomspännande distribution som kan infektera ett stort antal växtarter, inklusive potatis, tomat, tobak, banan, peppar och aubergine, bland annat1,2. Avkastning förluster orsakade av Ralstonia kan nå 80-90% av produktionen i tomat, potatis eller banan, beroende på sort, klimat, jord och andra faktorer3. Emellertid, Ralstonia modellen är betydligt underutforskad i jämförelse med andra modeller som involverar bakteriella växtpatogener, såsom Pseudomonas syringae eller Xanthomonas spp. Dessutom är de flesta studier i växt-mikrob interaktioner inriktade på modellen anläggningen Arabidopsis thaliana. Även om forskning med hjälp av dessa modeller till stor del har bidragit till vår förståelse av växt-bakterier interaktioner, de tar inte upp den nuvarande nödvändigheten att förstå dessa interaktioner i växtväxter. Forskning som syftar till att förstå samspelet mellan Ralstonia och växtväxter är viktigt att utveckla hållbara lösningar för att bekämpa bakteriell vissnande sjukdom, men för närvarande hindras av bristen på enkla experimentella analyser för att karakterisera de olika komponenterna i interaktionen. Särskilt tomat, en naturlig värd för Ralstonia, är den näst viktigaste grönsaksodlingen i världen och påverkas av en uppsjö av sjukdomar4, inklusive bakteriell vissna sjukdom. I detta arbete har vi utvecklat en enkel metod för att utföra genetisk analys av Ralstonia infektion av tomat. Denna metod är baserad på Agrobacterium rhizogenes-medieradomvandling av tomatrötter, med hjälp av DsRed fluorescens som urval markör5, följt av Ralstonia jord-dränkande inokulering av de resulterande växterna, som innehåller transformerade rötter som uttrycker byggandet av intresse. Mångsidigheten hos rotomvandlingsanalysen gör det möjligt att utföra antingen genöveruttryck eller genljuddämpning medhjälp av RNAi.
En potentiell begränsning av denna metod består av resttillväxt av icke-transformerade rötter. Detta är särskilt viktigt i de fall där plasmid används saknar en reporter gen som gör att valet av transformerade rötter. För att lösa detta problem har vi utvecklat en alternativ metod baserad på antibiotikaval, som hämmar tillväxten av icke-transformerade rötter samtidigt som tillväxten av friska antibiotikaresistenta transformerade rötter tillåts. Eftersom A. rhizogenes inte inducerar omvandlingen av skott, är de mottagliga för antibiotika, och därför bör de hållas åtskilda från det antibiotikainnehållande mediet.
Även om växtmotståndet mot Ralstonia inte är väl förstått, har flera rapporter associerade cellväggsförändringar till ökad motståndskraft mot bakteriell vissna6,7,8,9. Det har föreslagits att dessa cellvägg förändringar påverkar vaskulär utveckling, en viktig aspekt för livsstil Ralstonia inne i anläggningen10. Mutationer i gener som kodar cellulosasyntiserar CESA4, CESA7 och CESA8 i Arabidopsis talian har visat sig försämra sekundär cellväggintegritet, vilket orsakar ökat motstånd mot Ralstonia, som verkar vara kopplat till ABA signalering8. Därför, som ett proof of concept för vår metod, utförde vi RNAi-medierad gen ljuddämpning av SlCESA6 (Solyc02g072240), en sekundär cellulosasynthas för cellulosa och ortolog av AtCESA8 (At4g18780). Efterföljande jord-dränkning inokulering med Ralstonia visade att tysta SlCESA6 förbättrad motståndskraft mot bakteriell vissna symtom, vilket tyder på att cellen väggmedierad resistens mot Ralstonia sannolikt bevaras i tomat, och validera vår metod för att utföra genetisk analys av bakteriell vissna resistens i tomat rötter. Här beskriver vi denna metod i detalj, vilket gör det möjligt för genetiska metoder att förstå bakteriell vissna sjukdom på relativt kort tid och med små krav på utrustning och växttillväxtutrymme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ralstonia solanacearum utgör ett viktigt hot mot jordbruket. Dess interaktion med naturliga värdar av jordbruksbetydelse är dock fortfarande dåligt förstås jämfört med andra bakteriella patogener, särskilt hos växtarter. I de flesta fall hindras genetisk analys av den tid och de kostnader som krävs för att genetiskt modifiera värdväxter. För att lösa detta problem och underlätta genetisk analys av R. solanacearum infektion i tomat, har vi utvecklat en enkel metod baserad på Agrobac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar alla labbmedlemmar i Macho-laboratoriet för hjälpsamma diskussioner, Alvaro López-García för statistisk rådgivning och Xinyu Jian för tekniskt och administrativt bistånd under detta arbete. Vi tackar PSC Cell Biology kärnanläggning för hjälp med fluorescensimaging Detta arbete stöddes av strategic priority research program of the Chinese Academy of Sciences (grant XDB27040204), Shanghai Center for Plant Stress Biology (Chinese Academy of Sciences (grant XDB27040204), Shanghai Center for Plant Stress Biology (Chinese Academy of Sciences) och det kinesiska 1000 Talents-programmet.
Materials
| 90 mm square Petri-dishes | |||
| Agar powder | Sigma-Aldrich | ||
| Bacto peptone | BD (Becton and Dickinson) | ||
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | ||
| Filter paper | |||
| In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985 | Berthold Technologies | ||
| Jiffy pots | Jiffy Products International A.S. | ||
| Micropore tape | 3M | ||
| Murashige and Skoog medium (M519) | Phytotechlab | ||
| Pindstrup substrate | Pindstrup Mosebrug A/S | ||
| Scalpel and blade | |||
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | ||
| Sterile clean bench | |||
| Tweezers | |||
| Wahtman paper | Wahtman International Ltd. Maldstone | ||
| Yeast extract | OXOID |
References
- Jiang, G., et al. Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives. Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549 (2017).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Elphinstone, J. G., Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. . The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. , 9-28 (2005).
- Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. . Compendium of Tomato 1094 Diseases. , (1991).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Wydra, K., Beri, H. Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).
- Wydra, K., Beri, H. Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).
- Hernández-Blanco, C., et al. Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance. Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).
- Denancé, N., et al. Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism. Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).
- Digonnet, C., et al. Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall. Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).
- Sang, Y., et al. The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).
- Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts. New Phytologist. 192, 976-987 (2011).
- Wang, K., et al. Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum. Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- León-Morcillo, R. J., Martín-Rodríguez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling. Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).
- Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. Retire statistical significance. Nature. 567, 305-307 (2019).
