Gelijktijdige stroming cytometrische karakterisering van meerdere celtypen opgehaald uit muis hersenen/ruggenmerg via verschillende homogenisatie methoden
Summary
We presenteren een flow flowcytometrieonderzoeken methode om te identificeren gelijktijdig verschillende celtypen opgehaald uit muis hersenen of ruggenmerg. Deze methode kan worden benut om zuivere celpopulaties in neurodegeneratieve ziekten te isoleren of te karakteriseren of om de mate van celtargeting te kwantificeren bij in vivo toediening van virale vectoren of nanodeeltjes.
Abstract
Recente ontwikkelingen in virale vector-en nanomateriaal Wetenschappen hebben de weg geopend voor nieuwe geavanceerde benaderingen om het centrale zenuwstelsel (CNS) te onderzoeken of te manipuleren. Verdere optimalisatie van deze technologieën zou echter baat hebben bij methoden die een snelle en gestroomlijnde bepaling van de omvang van CNS en Cell-specifieke targeting bij toediening van virale vectoren of nanodeeltjes in het lichaam mogelijk maken. Hier presenteren we een protocol dat profiteert van de hoge doorvoer en multiplexing mogelijkheden van flow cytometrie om een eenvoudige kwantificering van verschillende celsubtypen geïsoleerd van muis hersenen of ruggenmerg, namelijk Microglia/macrofagen, lymfocyten, astrocyten, oligodendrocyten, neuronen en endotheliale cellen toe te staan. We passen deze aanpak toe om kritische verschillen tussen twee weefselhomogenisatie methoden in termen van celopbrengst, levensvatbaarheid en samenstelling te benadrukken. Dit kan de gebruiker instrueren om de beste methode te kiezen, afhankelijk van het celtype (s) van de interesse en de specifieke toepassing. Deze methode is niet geschikt voor de analyse van anatomische verdeling, omdat het weefsel wordt gehomogeniseerd om een eencellige suspensie te genereren. Echter, het maakt het mogelijk om te werken met levensvatbare cellen en het kan worden gecombineerd met celsortering, het openen van de weg voor verschillende toepassingen die het repertoire van gereedschappen in handen van de neurowetenschapper kunnen uitbreiden, variërend van de oprichting van primaire culturen afgeleid van zuivere celpopulaties, tot genexpressie analyses en biochemische of functionele assays op goed gedefinieerde celsubtypen in de context van neurodegeneratieve ziekten, bij farmacologische behandeling of gentherapie.
Introduction
Technologieën voor het leveren van genen en medicijnen (zoals virale vectoren en nanodeeltjes) zijn een krachtig hulpmiddel geworden dat kan worden toegepast om beter inzicht te krijgen in specifieke moleculaire trajecten die zijn veranderd in neurodegeneratieve ziekten en voor de ontwikkeling van innovatieve therapeutische benaderingen1,2,3. Optimalisatie van deze instrumenten is afhankelijk van de kwantificering van: (1) de mate van penetratie in het CZS op verschillende toedieningswegen en (2) targeting van specifieke celpopulaties. Histologische analyses worden meestal toegepast om fluorescerende reporter-genen of fluorescentie-gelabelde nanodeeltjes in verschillende CZS-gebieden en over verschillende celtypen te visualiseren, geïdentificeerd door immunokleuring voor specifieke celmarkeringen4,5. Hoewel deze aanpak waardevolle informatie verschaft over de biodistributie van het toegediende gen of medicamenteuze gereedschappen, kan de techniek tijdrovend en arbeidsintensief zijn, omdat dit vereist is: (1) weefsel fixatie, cryopreservatie of paraffine-inbedding en slicing; (2) kleuring voor specifieke cellulaire markers die soms antigeen-opvraging vereisen; (3) overname door fluorescentiemicroscopie, die gewoonlijk de analyse van een beperkt aantal verschillende markers binnen hetzelfde experiment mogelijk maakt; (4) beeldverwerking om een juiste kwantificering van het signaal van belang toe te staan.
Flow cytometrie is uitgegroeid tot een veelgebruikte techniek die gebruik maakt van zeer specifieke fluorescerende markers om niet alleen een snelle kwantitatieve evaluatie van verschillende celfenotypes in celsuspensies mogelijk te maken, op basis van de expressie van oppervlakte-of intracellulaire antigenen, maar ook functionele metingen (bijv. snelheid van apoptosis, proliferatie, celcyclus analyse, enz.). Fysiek isoleren van cellen door middel van fluorescerende geactiveerde celsortering is ook mogelijk, waardoor verdere downstreamtoepassingen (bijv. celkweek, RNAseq, biochemische analyses, enz.) 6,7,8.
Weefselhomogenisatie is een kritieke stap die noodzakelijk is om een enkelvoudige celsuspensie te verkrijgen om betrouwbare en reproduceerbaar stroomcytometrische evaluaties te kunnen ondergaan. Er zijn verschillende methoden beschreven voor de homogenisatie van volwassen hersenweefsel, voornamelijk met als doel Microglia-cellen9,10,11te isoleren; ze kunnen in het algemeen worden ingedeeld in twee hoofdcategorieën: (1) mechanische dissociatie, die slijp-of Afschuifkracht gebruikt door middel van een Dounce homogenisator (DH) om cellen uit hun nissen te rippen en een relatief gehomogeniseerde eencelsuspensie te vormen, en (2) enzymatische spijsvertering, die berust op incubatie van gehakt weefsel brokken bij 37 ° c in aanwezigheid van Proteolytische enzymen, zoals trypsine of papaïne, waarbij de afbraak van de extracellulaire matrix wordt begunstiging om een vrij gehomogeniseerde celsuspensie te creëren12.
Ongeacht welke methode wordt gebruikt, wordt een zuiveringsstap aanbevolen na weefselhomogenisatie om myeline te verwijderen door centrifugeren op een dichtheidsgradiënt of door magnetische selectie9,12, alvorens naar de downstreamtoepassingen te gaan.
Hier beschrijven we een weefsel verwerkingsmethode op basis van papaïne-spijsvertering (PD) gevolgd door zuivering op een dichtheidsgradiënt, geoptimaliseerd om levensvatbare heterogene celsuspensies te verkrijgen van muis hersenen of ruggenmerg in een tijdgevoelige manier en geschikt voor Flowcytometrie. Bovendien beschrijven we een 9-kleuren Flowcytometrie-paneel en de gating-strategie die we in het laboratorium hebben aangenomen om de gelijktijdige discriminatie van verschillende CNS-populaties, levende/dode cellen of positiviteit voor fluorescerende verslaggevers zoals groen fluorescerende eiwitten of Rhodamine-kleurstof mogelijk te maken. Door het toepassen van deze Flow cytometrische analyse, we kunnen vergelijken verschillende methoden van weefsel verwerking, dat wil zeggen, PD versus DH, in termen van behoud van cellulaire levensvatbaarheid en rendementen van verschillende celtypen.
De details die we hier verstrekken, kunnen een beslissing geven over het homogenisatie-protocol en de antilichaam combinatie die moet worden gebruikt in het Flowcytometrie paneel, op basis van het specifieke celtype (s) van belang en de stroomafwaartse analyses (bijv. temperatuurgevoelige toepassingen, tracering van specifieke fluorescentie markers, in vitro cultuur, functionele analyses).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin beschrijven we een protocol voor de co-zuivering en gelijktijdige Flow cytometrische analyse van enkele van de meest relevante CNS-cellen van muis hersenen en ruggenmerg. Traditioneel zijn histologische analyses toegepast om de verdeling van nanodeeltjes of de transductie-efficiëntie van virale vectoren in het CZS5,13te beschrijven of om inzichten te verschaffen over morfologische en moleculaire veranderingen die zich voordoen in specifieke celtypen tijde…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gefinancierd door de start-up fondsen van het Boston Children’s Hospital voor A.B., ALSA Grant nr. 17-IIP-343 tot M.P., en het kantoor van de adjunct-secretaris van defensie voor gezondheidszaken via het Amyotrofische laterale sclerose onderzoeksprogramma onder Awardnr. W81XWH-17-1-0036 tot M.P. We erkennen DFCI flow Cytometrie core voor technische ondersteuning.
Materials
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
- Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
- Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System. Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).
- Chen, S., et al. Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools. Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).
- Alves, S., et al. Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain. Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).
- Peviani, M., et al. Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons. Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Sykora, M. M., Reschke, M. Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).
- Legroux, L., et al. An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry. Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).
- Lee, J. K., Tansey, M. G. Microglia Isolation from Adult Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).
- Grabert, K., McColl, B. W. Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells. Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).
- Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Isolation and analysis of mouse microglial cells. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).
- Papa, S., et al. Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury. ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).
- Peviani, M., et al. Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation. Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).
- Peviani, M., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release. Biomaterials. 209, 25-40 (2019).
- Meng, F., et al. CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling. Brain. 142 (3), 700-718 (2019).
- Nedeljkovic, N. Complex regulation of ecto-5′-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation. Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).
