Gleichzeitige zytometrische Charakterisierung mehrerer Zelltypen, die durch verschiedene Homogenisierungsmethoden aus dem Maushirn/Spinalcord abgerufen wurden
Summary
Wir präsentieren eine Durchflusszytometrie-Methode, um gleichzeitig verschiedene Zelltypen zu identifizieren, die aus dem Gehirn oder Rückenmark der Maus abgerufen wurden. Diese Methode könnte genutzt werden, um reine Zellpopulationen bei neurodegenerativen Erkrankungen zu isolieren oder zu charakterisieren oder das Ausmaß der Zellausrichtung bei der In-vivo-Verabreichung von viralen Vektoren oder Nanopartikeln zu quantifizieren.
Abstract
Jüngste Fortschritte in den viralen Vektor- und Nanomaterialwissenschaften haben den Weg für neue innovative Ansätze zur Untersuchung oder Manipulation des Zentralnervensystems (ZNS) geebnet. Eine weitere Optimierung dieser Technologien würde jedoch von Methoden profitieren, die eine schnelle und schlanke Bestimmung des Ausmaßes von ZNS und zellspezifischem Targeting bei verabreichung von viralen Vektoren oder Nanopartikeln im Körper ermöglichen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die hohen Durchsatz- und Multiplexing-Fähigkeiten der Durchflusszytometrie nutzt, um eine einfache Quantifizierung verschiedener Zellsubtypen zu ermöglichen, die aus dem Gehirn oder Rückenmark der Maus isoliert sind, nämlich Mikroglia/Makrophagen, Lymphozyten, Astrozyten, Oligodendrozyten, Neuronen und Endothelzellen. Wir wenden diesen Ansatz an, um kritische Unterschiede zwischen zwei Gewebehomogenisierungsmethoden in Bezug auf Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Zusammensetzung hervorzuheben. Dies könnte den Benutzer anweisen, die beste Methode zu wählen, abhängig von den von Interesse sindden Zelltypen und der spezifischen Anwendung. Diese Methode eignet sich nicht für die Analyse der anatomischen Verteilung, da das Gewebe homogenisiert ist, um eine einzellige Suspension zu erzeugen. Es ermöglicht jedoch die Arbeit mit lebensfähigen Zellen und kann mit zellsortierung kombiniert werden, was den Weg für mehrere Anwendungen öffnet, die das Repertoire an Werkzeugen in den Händen des Neurowissenschaftlers erweitern könnten, von der Etablierung von Primärkulturen aus reinen Zellpopulationen bis hin zu Genexpressionsanalysen und biochemischen oder funktionellen Assays zu gut definierten Zellsubtypen im Kontext neurodegenerativer Erkrankungen, zur pharmakologischen Behandlung oder Gentherapie.
Introduction
Gen- und Medikamentenabgabetechnologien (wie virale Vektoren und Nanopartikel) sind zu einem leistungsfähigen Werkzeug geworden, das angewendet werden kann, um bessere Einblicke in spezifische molekulare Pfade zu gewinnen, die bei neurodegenerativen Erkrankungen verändert wurden, und für die Entwicklung innovativer therapeutischer Ansätze1,2,3. Die Optimierung dieser Werkzeuge beruht auf der Quantifizierung von: (1) dem Ausmaß der Penetration im ZNS auf verschiedenen Verabreichungswegen und (2) der Ausrichtung auf bestimmte Zellpopulationen. Histologische Analysen werden in der Regel angewendet, um fluoreszierende Reportergene oder fluoreszierend markierte Nanopartikel in verschiedenen ZNS-Bereichen und über verschiedene Zelltypen hinweg zu visualisieren, die durch Immunfärbung für bestimmte Zellmarker identifiziert werden4,5. Obwohl dieser Ansatz wertvolle Informationen über die Bioverteilung des verabreichten Gens oder der Instrumente zur Medikamentenabgabe liefert, kann die Technik zeitaufwändig und arbeitsintensiv sein, da sie Folgendes erfordert: (1) Gewebefixierung, Kryokonservierung oder Paraffineinbettung und Schneiden; (2) Färbung für bestimmte zelluläre Marker, die manchmal Antigen-Retrieval erfordern; (3) Erfassung durch Fluoreszenzmikroskopie, die in der Regel die Analyse einer begrenzten Anzahl verschiedener Marker innerhalb desselben Experiments ermöglicht; (4) Bildverarbeitung, um eine ordnungsgemäße Quantifizierung des Interessensignals zu ermöglichen.
Die Durchflusszytometrie ist zu einer weit verbreiteten Technik geworden, die sehr spezifische Fluoreszenzmarker nutzt, um nicht nur eine schnelle quantitative Auswertung verschiedener Zellphänotypen in Zellsuspensionen zu ermöglichen, basierend auf der Expression von Oberflächen- oder intrazellulären Antigenen, sondern auch funktionelle Messungen (z. B. Apoptoserate, Proliferation, Zellzyklusanalyse usw.). Die physikalische Isolierung von Zellen durch fluoreszierende aktivierte Zellsortierung ist ebenfalls möglich, was weitere nachgelagerte Anwendungen (z.B. Zellkultur, RNAseq, biochemische Analysen usw.) ermöglicht. 6,7,8.
Die Gewebehomogenisierung ist ein kritischer Schritt, der notwendig ist, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, um zuverlässige und reproduzierbare zytometrische Auswertungen nachdemdurchzuermöglichen. Für die Homogenisierung des Gehirns und des Gehirngewebes wurden verschiedene Methoden beschrieben, hauptsächlich mit dem Ziel, Mikrogliazellen9,10,11zu isolieren; sie können insgesamt in zwei Hauptkategorien eingeteilt werden: (1) mechanische Dissoziation, die Schleif- oder Scherkraft durch einen Dounce Homogenisator (DH) verwendet, um Zellen aus ihren Nischen zu reißen und eine relativ homogenisierte Einzelzellsuspension zu bilden, und (2) enzymatische Verdauung, die auf inkubation von hackenden Gewebestücken bei 37 °C in Gegenwart von proteolytischen Enzymen wie Trypsin oder Papain beruht, was den Abbau der extrazellulären Matrix begünstigt, um eine fair homogeneZellezu erzeugen.
Unabhängig davon, welche Methode verwendet wird, wird nach der Gewebehomogenisierung ein Reinigungsschritt empfohlen, um Myelin durch Zentrifugation auf einem Dichtegradienten oder durch magnetische Selektion9,12zu entfernen, bevor man zu den nachgeschalteten Anwendungen übergeht.
Hier beschreiben wir ein Gewebeverarbeitungsverfahren auf Basis der Papainverdauung (PD), gefolgt von der Reinigung auf einem Dichtegradienten, optimiert, um lebensfähige heterogene Zellsuspensionen aus dem Maushirn oder Rückenmark zeitempfindlich und für die Durchflusszytometrie geeignet zu erhalten. Darüber hinaus beschreiben wir ein 9-farbene Strömungszytometrie-Panel und die Gating-Strategie, die wir im Labor angenommen haben, um die gleichzeitige Diskriminierung verschiedener ZNS-Populationen, lebender/toter Zellen oder Positivität für fluoreszierende Reporter wie grünes fluoreszierendes Protein oder Rhodaminfarbstoff zu ermöglichen. Durch die Anwendung dieser zytometrischen Durchflussanalyse können wir verschiedene Methoden der Gewebeverarbeitung, d.h. PD versus DH, in Bezug auf die Erhaltung der zellulären Lebensfähigkeit und der Erträge verschiedener Zelltypen vergleichen.
Die Details, die wir hierin angeben, können die Entscheidung über das Homogenisierungsprotokoll und die Antikörperkombination in der Durchflusszytometrie-Platte auf der Grundlage der spezifischen Zelltypen von Interesse und der nachgelagerten Analysen (z. B. temperaturempfindliche Anwendungen, Verfolgung spezifischer Fluoreszenzmarker, In-vitro-Kultur, funktionelle Analysen).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hierin beschreiben wir ein Protokoll zur Koreinigung und parallelen zytometrischen Analyse von einigen der relevantesten ZNS-Zellen aus Demhirn und Rückenmark. Traditionell wurden histologische Analysen durchgeführt, um die Verteilung von Nanopartikeln oder die Transduktionseffizienz viraler Vektoren im ZNS5,13zu beschreiben oder Um Erkenntnisse über morphologische und molekulare Veränderungen zu geben, die in bestimmten Zelltypen während einer Pathologie od…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von Denbeinen des Boston Children es Hospital an A.B., ALSA-Stipendium nr. 17-IIP-343 an M.P., und das Büro des Stellvertretenden Verteidigungsministers für Gesundheitsangelegenheiten durch das Amyotrophe Lateral sklerose Forschungsprogramm unter Auszeichnung Nr. W81XWH-17-1-0036 zu M.P. Wir würdigen DFCI Flow Cytometry Core für technischen Support.
Materials
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
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