Summary

אפיון מרובה של סוגי תאים שאוחזרו ממוח העכבר/חוט השדרה דרך שיטות הומוקות שונות

Published: November 19, 2019
doi:

Summary

אנו מציגים שיטת הזרמה cy, כדי לזהות בו סוגי תאים שונים שאוחזרו ממוח העכבר או חוט השדרה. שיטה זו יכול להיות מנוצל כדי לבודד או לאפיין אוכלוסיות תאים טהורה במחלות ניווניות או לכמת את היקף המיקוד של התא על vivo ניהול של וקטורים ויראליות או חלקיקים.

Abstract

ההתקדמות האחרונה ב וקטורים וקטוריים ומדעי הננו פתחו את הדרך לגישות חדשניות לקידום החקירה או לטיפול במערכת העצבים המרכזית (CN). עם זאת, אופטימיזציה נוספת של טכנולוגיות אלה היה להפיק תועלת מהשיטות המאפשרות מהירה ולייעל את היקף מידת המיקוד הספציפי לתא על ניהול של וקטורים ויראליות או חלקיקים בגוף. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אשר מנצל את התפוקה הגבוהה ואת יכולות ריבוב של זרימה cy, נסה לאפשר כימות ישירה של תת תאים שונים מבודדים ממוח העכבר או חוט השדרה, כלומר microglia/מקרופאגים, לימפוציטים, astrocytes, oligodendrocytes הפוך, נוירונים ותאי אנדותל. אנו מיישמים גישה זו כדי להדגיש הבדלים קריטיים בין שתי שיטות הומוקות רקמות במונחים של התשואה התא, הכדאיות והקומפוזיציה. הדבר יכול להורות למשתמש לבחור את השיטה הטובה ביותר בהתאם לסוג התא (ים) של עניין וליישום הספציפי. שיטה זו אינה מתאימה לניתוח של התפלגות אנטומית, שכן הרקמה היא הומוגניים כדי ליצור השעיה תא בודד. עם זאת, הוא מאפשר לעבוד עם תאים קיימא והוא יכול להיות משולב עם מיון תאים, פתיחת הדרך עבור מספר יישומים שיכולים להרחיב את הרפרטואר של כלים בידיים של נוירומדען, החל הקמת התרבויות הראשיות נגזר אוכלוסיות תאים טהורים, לניתוח גנים ביטוי ביוכימיים או פונקציונלי מוגדר על תת-מוגדרים היטב תאים בהקשר של מחלות ניווניות, על טיפול תרופתי או טיפול גנטי.

Introduction

ג’ין וטכנולוגיות משלוח התרופה (כגון וקטורים וקטורי חלקיקים) הפכו כלי רב עוצמה שניתן להחיל כדי להשיג תובנות טובות יותר על מסלולים מולקולריים ספציפיים שונה במחלות ניווניות ולפיתוח גישות טיפוליות חדשניות1,2,3. אופטימיזציה של כלים אלה מסתמך על כימות של: (1) את היקף החדירה בתוך ה-CN על נתיבי שונים של ניהול ו (2) פילוח של אוכלוסיות תאים ספציפיות. ניתוחים היסטלוגיים מוחלים בדרך כלל על הדמיה של הכתב הפלורסנט גנים או fluorescently אופן מתויג חלקיקים באזורים שונים של המרכז העצמי ועל פני סוגי תאים שונים, מזוהה על ידי כתמים חיסוני עבור סמנים תא ספציפיים4,5. למרות גישה זו מספקת מידע רב ערך על ההתפלגות הביומלית של הגן המנוהל או כלי משלוח התרופות, הטכניקה יכולה להיות גוזלת זמן עבודה אינטנסיבית מאז שהוא דורש: (1) קיבוע רקמות, הקפאה או פרפין-הטבעה וחותך; (2) כתמים עבור סמנים סלולריים ספציפיים לעתים דורשים אחזור אנטיגן; (3) רכישה של מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית, אשר בדרך כלל מאפשר ניתוח של מספר מוגבל של סמנים שונים בתוך אותו ניסוי; (4) עיבוד תמונה כדי לאפשר קוונפיקציה נאותה של אות הריבית.

הפכה cy, להיות טכניקה בשימוש נרחב אשר מנצל סמני פלורסנט ספציפיים מאוד כדי לאפשר לא רק הערכה כמותית מהירה של פנוטיפים תא שונים בשעיות התא, מבוסס על הביטוי של אנטיגנים או משטחים, אלא גם מדידות תפקודית (g., שיעור של אפופטוזיס, התפשטות, ניתוח מחזור התא, וכו ‘). בידוד פיזי של תאים באמצעות פלורסנט מופעל מיון התא אפשרי גם, המאפשר במורד הזרם יישומים (למשל, תרבות התא, RNAseq, ניתוחים ביוכימיים וכו ‘) . שש,שבע,שמונה

המגון רקמה היא צעד קריטי הכרחי כדי לקבל השעיית תא בודד כדי לאפשר אמין ומלא להזרים הערכות בזרם הסייטומטרימטרי. שיטות שונות תוארו עבור למבוגרים רקמת המוח המגון, בעיקר עם המטרה לבודד תאים מיקרוגלייה9,10,11; הם יכולים להיות מסווגים באופן כללי בשתי קטגוריות עיקריות: (1) דיסוציאציה מכנית, אשר משתמשת שחיקה או הטיית כוח באמצעות הומוגניד Dounce (DH) כדי לקרוע את התאים מתוך נישות שלהם וליצור הבולם הומוגניים באופן יחסי הולם התא היחיד, ו (2) העיכול האנזימטי, המסתמך על דגירה של נתחי רקמות טחון ב-37 ° c בנוכחות אנזימים בעלי חרדה, כגון טריפסין או פאפאין, העדפה על השפלה של המטריצה המגמטית ליצור השעיית תאים הומוגניים למדי12.

ללא קשר לשיטה מנוצל, צעד טיהור מומלץ לאחר המגון רקמות להסיר את המיאלין דרך צנטריפוגה על הדרגתי צפיפות או על ידי בחירה מגנטית9,12, לפני המעבר יישומים במורד הזרם.

כאן, אנו מתארים שיטת עיבוד רקמות מבוסס על העיכול פפאין (PD) ואחריו טיהור על הדרגתי צפיפות, אופטימיזציה כדי להשיג השעיות תא הטרוגנית קיימא ממוח העכבר או חוט השדרה באופן רגיש זמן ומתאים לזרימה cy, try. יתר על כן, אנו מתארים 9-צבע הפאנל cy, לנסות את האסטרטגיה שאימצנו במעבדה כדי לאפשר את האפליה הסימולטני של אוכלוסיות שונות של ה-CN, חי/מת תאים או חיוביות עבור כתבים פלורסנט כגון חלבון פלורסנט ירוק או צבע rhodamine. על-ידי החלת ניתוח זה של הזרימה, אנו יכולים להשוות שיטות שונות של עיבוד רקמות, כלומר, PD מול DH, מבחינת שימור הכדאיות התאית ותשואות של סוגי תאים שונים.

הפרטים שאנו מספקים במסמך זה יכולים להורות על החלטה על פרוטוקול המגון ושילוב הנוגדן לשימוש בלוח הזרימה cy, מבוסס על סוג תא (ים) מסוים של עניין וניתוח במורד הזרם (g., רגישות לטמפרטורה יישומים, מעקב אחר סמני פלורסנט ספציפיים, בתרבות חוץ גופית, ניתוחים פונקציונליים).

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של דנה פרבר סרטן המכון (פרוטוקול מספר 16-024). 1. הכנת הפתרונות הדרושים לניסוי הכינו את פתרון המלח המאוזן של האנק (HBSS) על ידי דילול של 10 x HBSS עם מים סטריליים. . לפני שתרגיע את הפתרון בקרח לפחות 25 מ ל של פתר…

Representative Results

השוונו שתי שיטות שונות של הומוגון (DH נגד PD) להחיל על המוח העכבר ואת חוט השדרה, כדי לבדוק את היעילות באחזור סוגי תאים שונים קיימא מתאים ליישומי מטה. כדי לעשות זאת, אנו מנצלים 9-צבע הפאנל cy, לנסות לאפיין, במדגם זהה, סוגים שונים של תאי ה-CN הכוללים microglia, לימפוציטים, נוירונים, astrocytes, oligodendrocytes הפוך ו ?…

Discussion

כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח שיתוף טיהור וזרימה במקביל של חלק מתאי ה-CN הרלוונטיים ממוח העכבר וחוט השדרה. באופן מסורתי, ניתוחים היסטולוגיים הוחלו כדי לתאר את התפלגות חלקיקים או את היעילות התמרה של וקטורים ויראליות ב-cn5,13, או כדי לספק תובנות על שינויים מורפו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי כספי הסטארט-up של בית החולים לילדים של בוסטון א יהושע, ALSA גרנט nr. 17-IIP-343 כדי לעשות זאת, והמשרד של עוזר מזכיר ההגנה לענייני בריאות באמצעות תוכנית המחקר טרשת לרוחב Amyotrophic תחת הפרס לא. W81XWH-17-1-0036 ל-שוטרים אנו מכירים DFCI זרימה Cysupport ליבה לתמיכה טכנית.

Materials

10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) Gibco 14185-052
70 mm Cell Strainer Corning 431751
ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody Miltenyi Biotec 130-117-535 APC conjugated
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9647-1KG
CD11b rat anti-mouse antibody Invitrogen 47-0112-82 APC-eFluor 780 conjugated
CD31 rat anti-mouse antibody BD Bioscience 562939 BV421 conjugated
CD45 rat anti-mouse antibody Biolegend 103138 Brilliant Violet 510 conjugated
CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody Biolegend 202518 PE/Cy7 conjugated
CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody Biolegend 1005325 PE/Cy7 conjugated
Conical Tubes (15 mL) CellTreat 229411
Conical Tubes (50 mL) CellTreat 229422
Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) Sigma-Aldrich D9063-1SET
Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody BD Pharmingen 553142
Fetal Bovine Serum Benchmark 100-106
Neural Tissue Dissociation Kit (P) Miltenyi Biotec 130-092-628
O4 anti mouse/rat/human antibody Miltenyi Biotec 130-095-895 Biotin conjugated
Percoll GE Healthcare 10266569 sold as not sterile reagent
Percoll Sigma 65455529 sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)
Percoll PLUS Sigma GE17-5445-01 reagent containing very low traces of endotoxin
Streptavidin Invitrogen S3258 Alexa Fluor 680 conjugated

References

  1. Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
  2. Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System. Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).
  3. Chen, S., et al. Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools. Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).
  4. Alves, S., et al. Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain. Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).
  5. Peviani, M., et al. Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons. Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).
  6. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  7. Sykora, M. M., Reschke, M. Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).
  8. Legroux, L., et al. An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry. Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).
  9. Lee, J. K., Tansey, M. G. Microglia Isolation from Adult Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).
  10. Grabert, K., McColl, B. W. Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells. Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).
  11. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).
  12. Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Isolation and analysis of mouse microglial cells. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).
  13. Papa, S., et al. Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury. ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).
  14. Peviani, M., et al. Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation. Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).
  15. Peviani, M., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release. Biomaterials. 209, 25-40 (2019).
  16. Meng, F., et al. CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling. Brain. 142 (3), 700-718 (2019).
  17. Nedeljkovic, N. Complex regulation of ecto-5′-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation. Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).
check_url/60335?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. J. Vis. Exp. (153), e60335, doi:10.3791/60335 (2019).

View Video