다른 균질화 방법을 통해 마우스 뇌 / 척수에서 검색 된 여러 세포 유형의 동시 유량 세포 측정 특성 분석
Summary
우리는 마우스 두뇌 또는 척수에서 검색된 동시에 다른 세포 모형을 확인하기 위하여 교류 세포측정 방법을 제시합니다. 이 방법은 신경 퇴행성 질환에서 순수 한 세포 집단을 분리하거나 특성화하거나 바이러스 벡터 또는 나노 입자의 생체 내 투여 시 세포 표적화의 정도를 정량화하기 위해 악용 될 수 있습니다.
Abstract
바이러스 벡터 및 나노 물질 과학의 최근 발전은 중추 신경계를 조사하거나 조작하는 새로운 최첨단 접근법 (CNS)의 길을 열었습니다. 그러나, 이러한 기술의 추가 최적화는 체내에서 바이러스 벡터 또는 나노 입자의 투여 시 CNS 및 세포 별 표적화의 정도를 신속하고 능률적인 측정을 허용하는 방법의 혜택을 누릴 것입니다. 여기에서, 우리는 마우스 두뇌 또는 척수, 즉 microglia/대식세포, 림프세포, 성상세포, 올리고덴드로세포, 올리고덴드로소이트, 내피 세포에서 분리된 상이한 세포 아류형의 간단한 정량화를 허용하기 위해 유세포분석의 높은 처리량 및 다중화 기능을 활용하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 세포 수율, 생존력 및 조성의 관점에서 두 조직 균질화 방법 사이의 중요한 차이점을 강조하기 위해이 방법을 적용합니다. 이렇게 하면 사용자가 관심 있는 셀 유형 및 특정 응용 프로그램에 따라 최상의 방법을 선택하도록 지시할 수 있습니다. 이 방법은 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 조직이 균질화되기 때문에 해부학 적 분포의 분석에 적합하지 않습니다. 그러나, 그것은 가능한 세포로 작동할 수 있고, 순수한 세포 인구에서 파생된 1 차적인 배양의 설치에서, 신경 퇴행성 질병의 맥락에서 잘 정의된 세포 특수학 또는 기능적인 분석, 신경 퇴행성 질병의 맥락에서 잘 정의된 세포 특수학 또는 기능적인 분석학에 구역 수색하는 신경과학자의 손에 있는 공구의 레퍼토리를 확장할 수 있는 몇몇 응용을 위한 방법을 여는 세포 분류와 결합될 수 있습니다.
Introduction
유전자 및 약물 전달 기술(예: 바이러스 벡터 및 나노입자)은 신경 퇴행성 질환에서 변경된 특정 분자 경로에 대한 더 나은 통찰력을 얻고 혁신적인 치료 접근법의개발을 위해 적용할 수 있는 강력한 도구가 되었습니다1,2,3. 이러한 도구의 최적화는 정량화에 의존합니다: (1) 다른 투여 경로에 대한 CNS의 침투 범위 및 (2) 특정 세포 집단의 표적화. 조직학적 분석은 일반적으로 특정 세포마커4,5에대한 면역 염색에 의해 확인된 다른 CNS 지역 및 상이한 세포 모형에 있는 형광 리포터 유전자 또는 형광 태그나노입자를 구상하기 위하여 적용됩니다. 이 접근법은 투여된 유전자 또는 약물 전달 도구의 생체 분포에 대한 귀중한 정보를 제공하지만, 이 기술은 (1) 조직 고정, 동결 보존 또는 파라핀 삽입 및 슬라이스를 필요로 하기 때문에 시간이 많이 걸리고 노동이 강렬할 수 있다; (2) 때로는 항원 검색을 필요로 하는 특정 세포 마커에 대한 염색; (3) 형광 현미경 검사법에 의한 획득, 이는 일반적으로 동일한 실험 내에서 제한된 수의 다른 마커의 분석을 가능하게 한다; (4) 관심 있는 신호를 적절히 정량화할 수 있도록 이미지 처리.
유세포 분석은 표면 또는 세포 내 항원의 발현에 기초하여 세포 현탁액에서 다른 세포 표현형의 신속한 정량적 평가뿐만 아니라 기능적 측정 (예를 들어, 세포 사멸의 속도, 증식, 세포 주기 분석 등)를 허용하기 위해 매우 특이적 형광 마커를 활용하는 널리 사용되는 기술이되었습니다. 형광 활성화 세포 선별을 통한 세포의 물리적 분리도 가능하여 추가다운스트림 응용(예: 세포 배양, RNAeq, 생화학 적 분석 등)을 허용합니다. 6,7,8.
조직 균질화는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 하류 유동 세포 측정 평가를 허용하기 위해 단일 세포 현탁액을 얻는 데 필요한 중요한 단계입니다. 다른 방법은 성인 뇌 조직 균질화를 위해 설명되었으며, 주로 미세 글리아 세포를 분리하는 것을 목표로9,10,11; 그들은 전반적으로 두 가지 주요 범주로 분류 될 수있다 : (1) Dounce 균질화 (DH)를 통해 연삭 또는 전단력을 사용하여 틈새 에서 세포를 찢어 상대적으로 균질화 된 단일 세포 현탁액을 형성하는 기계적 해리, 및 (2) 효소 소화는 37°C에서 다진 조직 덩어리의 인큐베이션에 의존하며, 트립신 또는 파파인과 같은 단백질 분해 효소의 존재, 상당히 균질화된 세포현탁액(12)을생성하기 위해 세포외 매트릭스의 분해를 선호한다.
어떤 방법을 활용하든, 정화 단계는 조직 균질화 후 밀도 구배 또는 자기 선택9,12에의해 원심분리를 통해 미엘린을 제거하기 위해 하류 응용 프로그램으로 이동하기 전에 권장됩니다.
여기서, 우리는 파파인 소화(PD)에 기초한 조직 처리 방법을 설명하고 밀도 구도에 대한 정제를 거쳐, 시간 민감성 방식으로 마우스 뇌 또는 척수로부터 생존 가능한 이기종 세포 현탁액을 얻기 위해 최적화되고 유세포 분석에 적합하다. 또한, 우리는 녹색 형광 단백질 또는 로다민 염료와 같은 형광 기자를 위한 다른 CNS 인구, 살아있는/죽은 세포 또는 양성의 동시 적인 차별을 허용하기 위하여 실험실에서 채택한 9 색 교류 세포 측정 위원회 및 게이팅 전략을 기술합니다. 이 유동 세포 측정 분석을 적용함으로써, 우리는 조직 처리의 다른 방법을 비교할 수 있습니다, 즉, PD 대 DH, 세포 생존력과 다른 세포 유형의 수율의 보존측면에서.
본 명세서에서 당사가 제공하는 세부 사항은 관심 있는 특정 세포 유형 및 다운스트림 분석(예를 들어, 온도 민감성)에 기초하여 유세포측정 패널에서 사용하는 균질화 프로토콜 및 항체 조합에 대한 결정을 지시할 수 있다. 특정 형광 마커 추적, 시험관 내 배양, 기능 분석).
Protocol
Representative Results
Discussion
본 명세서에서 우리는 마우스 뇌 및 척수로부터 가장 관련성이 높은 CNS 세포의 일부의 동시 정제 및 동시 유동 세포측정 분석을 위한 프로토콜을 기술한다. 전통적으로, 조직학 분석은 CNS5,13에서바이러스 벡터의 나노입자 또는 트랜스덕션 효율의 분포를 설명하거나, 병리학 또는 약리학적 치료 시 특정 세포 유형에서 발생하는 형태학적 및 분자 변화에…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 A.B., ALSA 교부금 nr에 보스턴 아동 병원 창업 기금에 의해 투자되었습니다. 17-IIP-343에서 M.P.에, 그리고 상 번호에 따라 근위축성 측삭 경화증 연구 프로그램을 통해 건강 담당 차관의 사무실. W81XWH-17-1-0036 ~ M.P. 우리는 기술 지원을 위해 DFCI 흐름 세포 측정 코어를 인정합니다.
Materials
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
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