JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Genetisk modifikation af cyanobakterier ved konjugering ved hjælp af det modulære Cyanogat klonings værktøjssæt

Published: October 31, 2019
doi:
10.3791/60451
, , , ,
1Institute of Molecular Plant Sciences, School of Biological Sciences,University of Edinburgh, 2Centre for Synthetic and Systems Biology,University of Edinburgh, 3Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences,University of Edinburgh

Summary

Her præsenterer vi en protokol, der beskriver hvordan i) samler en selvkopierende vektor ved hjælp af den modulære CyanoGate klonings værktøjssæt, II) indfører vektoren i en cyanobakterial vært ved konjugering, og III) karakteriserer transgene cyanobakterier stammer ved hjælp af en plade læseren eller flowcytometri.

Abstract

Cyanobakterier er en mangfoldig gruppe af prokaryotiske fotosyntetiske organismer, der kan modificeres genetisk til vedvarende produktion af brugbare industrivarer. Nylige fremskridt inden for syntetisk biologi har ført til udvikling af flere klonings værktøjssæt som cyanogat, et standardiseret modulært klonings system til opbygning af plasmid-vektorer til efterfølgende omdannelse eller ægteskabelige overførsel til cyanobakterier. Her skitserer vi en detaljeret metode til montering af en selvkopierende vektor (f. eks. med et fluorescerende markør udtryks kassette) og konjugeret overførsel af vektoren til cyanobakteriale stammer Synechocystis Sp. pcc 6803 eller Synechococcus elongatus utex 2973. Derudover skitserer vi, hvordan man karakteriserer udførelsen af en genetisk del (f. eks. en promotor) ved hjælp af en plade læser eller flow cytometri.

Introduction

Cyanobakterier er autotrofisk bakterier, der kan anvendes til biosyntesen af en bred vifte af naturlige og heterologe høj værdi metaboliske produkter1,2,3,4,5, 6. Flere forhindringer skal stadig overvindes for at udvide deres kommercielle levedygtighed, især de relativt dårlige udbytter i forhold til heterotrofisk bio-platforme (f. eks. Escherichia coli og gær)7. Den nylige udvidelse af de tilgængelige genteknologiske værktøjer og udbredelsen af det syntetiske biologi paradigme inden for cyanobakteriel forskning bidrager til at overvinde sådanne udfordringer og videreudvikle cyanobakterier som effektive biofactorier8, 9,10.

De vigtigste tilgange til indførelse af DNA i cyanobakterier er omdannelse, konjugering og elektroporation. De vektorer, der overføres til cyanobakterier ved omdannelse eller elektroporation, er “selvmords vektorer” (dvs. Integrative vektorer, som letter homologe rekombination), mens selvkopierende vektorer kan overføres til cyanobakterier ved omdannelse, konjugering eller elektroporation. For førstnævnte, en protokol er tilgængelig for Engineering model arter modtagelig for naturlig transformation11. For nylig, en modulær kloning (MoClo) Toolkit for cyanobakterier kaldet Cyanogat er blevet udviklet, der beskæftiger en standardiseret Golden Gate vektor montage metode til teknik ved hjælp af naturlig transformation, elektro poration eller konjugering12.

Golden Gate-type montage teknikker er blevet stadig mere populære i de seneste år, og montage standarder og del biblioteker er nu tilgængelige for en række organismer13,14,15,16 ,17. Golden Gate brugertype IIS restriktionsenzymer (f. eks BsaI, BpiI, BsmBI, BtgZI og AarI) og en dragt af acceptorer og unikke udhæng for at lette retningsbestemt hierarkisk samling af flere sekvenser i en “en pot” assembly reaktion. Type IIS-begrænsnings enzymer genkender en unik asymmetrisk sekvens og skærer en defineret afstand fra deres genkendelses steder for at generere en forskudt, “klæbrig ende” udskæring (typisk en 4 nucleotid [NT] udhæng), som efterfølgende kan udnyttes til at drive bestilt DNA monterings reaktioner15,18. Dette har lettet udviklingen af store biblioteker af modulære niveau 0 dele (f. eks initiativtagere, åbne læse rammer og terminatorer) defineret ved en fælles syntaks, såsom PhytoBricks standard19. Niveau 0 dele kan derefter let samles i niveau 1 udtryk kassetter, hvorefter mere komplekse højere ordre samlinger (f. eks multi gene Expression konstruktioner) kan bygges i en acceptor vektor af valg12,15. En vigtig fordel ved montering af gyldne Gate-typer er deres modtagelighed for automatisering ved højkapacitets anlæg, såsom DNA-støberier20,21, som kan muliggøre afprøvning af komplekse eksperimentelle designs, der kan ikke nemt opnås ved manuel arbejdskraft.

Cyanogat bygger på det etablerede Plant moclo system12,15. For at indarbejde en ny del i Cyanogat, skal den del sekvens først være domesticerede, dvs “ulovlige” anerkendelse sites for BsaI og BpiI skal fjernes. I tilfælde af en del kodning for en åben læse ramme (dvs. en kodnings sekvens, cd’er), kan genkendelses stederne forstyrres ved at generere synonyme mutationer i sekvensen (dvs. ændre en codon til et alternativ, der koder for den samme aminosyre rest). Dette kan opnås ved en række forskellige tilgange, lige fra DNA-syntese til polymerase kædereaktion (PCR) forstærknings baserede strategier som Gibson assembly22. Afhængigt af det udtryk vært, der anvendes, bør der udvises forsigtighed for at undgå indførelsen af sjældne kodon, der kan hæmme effektiviteten af oversættelse23. Fjernelse af genkendelses websteder i promotor-og terminatorsekvenser er typisk en mere risikobetonet bestræbelse, da ændringer kan påvirke funktionen, og delen muligvis ikke fungerer som forventet. For eksempel kan ændringer i formodede transskriptionsfaktor bindingssteder eller ribosom-bindingsstedet i en promotor ændre styrke og reaktionsevne over for induktion/undertrykkelse. På samme måde kan ændringer af centrale Terminator strukturelle funktioner (f. eks GC rige stilk, loop og poly-U hale) ændre termineringseffekten og effekt genekspression24,25. Selv om der er flere online ressourcer til rådighed til at forudsige aktiviteten af promotor-og terminatorsekvenser og oplyse, om en foreslået mutation vil påvirke ydeevnen26,27, er disse værktøjer ofte dårlige prædiktorer for ydeevne i cyanobakterier28,29,30.. Som sådan, in vivo karakterisering af modificerede dele anbefales stadig at bekræfte aktiviteten. For at hjælpe med kloning af genstridige sekvenser, cyanogate omfatter en lav kopi kloning acceptor vektor baseret på biobrick vektor pSB4K512,16,31. Desuden er en “design og build” Portal tilgængelig gennem Edinburgh Genome Foundry til at hjælpe med vektor design (dab.genomefoundry.org). Endelig, og vigtigst af alt, omfatter CyanoGate to niveau T acceptor vektor designs (svarende til niveau 2 acceptor vektorer)15 for at indføre DNA i cyanobakterier ved hjælp af selvmords vektorer, eller brede Host-Range vektorer i stand til selv-replikation i flere cyanobakteriale arter32,33,34.

Her vil vi fokusere på at beskrive en protokol til generering af niveau T selvkopierende vektorer og den genetiske modifikation af Synechocystis pcc 6803 og Synechococcus elongatus Utex 2973 (synechocystis PCC 6803 og S. elongatus Utex 2973 herefter) ved konjugering (også kendt som Tri-Parental Mating). Conjugal overførsel af DNA mellem bakterieceller er en velbeskrevet proces og er tidligere blevet anvendt til ingeniør cyanobakteriale arter, især dem, der ikke er naturligt kompetente, såsom S. elongatus utex 297335, 36,37,38,39,40,41. Kort sagt inkuberes cyanobakteriale kulturer med en E. coli -stamme, der bærer vektoren, og som skal overføres (“Cargo”-vektoren) og vektorer (enten i den samme E. coli -stamme eller i yderligere stammer) for at muliggøre konjugering (“mobilizer” og “hjælpe” vektorer). Der er behov for fire nøglebetingelser for overførsel af konjugering: 1) direkte kontakt mellem de celler, der er involveret i DNA-overførsel, 2) last vektoren skal være kompatibel med konjugations systemet (dvs. den skal indeholde en egnet overførings kilde (Orit), også kendt som en bom (grund af mobilitet) site), 3) et DNA nicking protein (f. eks, kodet af Mob genet), at Nicks DNA på Orit at initiere enkelt-strandede overførsel af DNA til cyanobacterium skal være til stede og udtrykkes fra enten lasten eller hjælpe vektorer, og 4) det overførte DNA må ikke destrueres i recipient cyanobacterium (dvs. skal være modstandsdygtig over for nedbrydning ved f. eks. begrænsningens endonukleaseaktivitet)35,42. For at last vektoren kan fortsætte, skal Replikeringens oprindelse være kompatibel med modtageren cyanobacterium for at give mulighed for selv-replikering og spredning i datter celler post division. For at støtte med betingelser 3 og 4 er flere hjælpe vektorer tilgængelige via Addgene og andre kommercielle kilder, der koder for Mob samt flere methylaser for at beskytte mod indfødte endonukleaser i værten cyanobacterium43. I denne protokol blev konjugering lettet af en MC1061 E. coli -stamme, der bærer mobilizer-og hjælpe vektorer pRK24 (henholdsvis www. addgeneorg/51950) og pRL528 (www.addgene.org/58495). Man skal være forsigtig, når man vælger de vektorer, der skal anvendes til konjugat overførsel. For eksempel, i CyanoGate kit den selvkopierende Cargo vektor pPMQAK1-T koder for en Mob protein12. Men, pSEVA421-T ikke44, og som sådan, Mob skal udtrykkes fra en egnet hjælper vektor. De vektorer, der anvendes, bør også være passende for målorganismen. For eksempel kræver effektiv konjugat overførsel i Anabaena Sp. pcc 7120 en hjælpe vektor, der beskytter mobilizer-vektoren mod fordøjelsen (f. eks. pRL623, som koder for de tre Methylaser Avaim, Eco47iiM og Ecot22iM)45, 46.

I denne protokol skitserer vi yderligere, hvordan man karakteriserer ydeevnen af dele (dvs. initiativtagere) med en fluorescerende markør ved hjælp af en plade læser eller et flow cytometer. Flowcytometre er i stand til at måle fluorescens på en enkelt celle basis for en stor population. Desuden giver flow cytometre brugerne mulighed for at “gate” de erhvervede data og fjerne baggrundsstøj (f. eks. fra partikler i kulturen eller kontaminering). I modsætning hertil erhverver plade læsere en samlet fluorescens måling af en given mængde kultur, typisk i flere replikat brønde. De vigtigste fordele ved plade læsere over cytometre omfatter lavere omkostninger, højere tilgængelighed og typisk ingen krav til specialsoftware til downstream-dataanalyser. De største ulemper ved plade læsere er den relativt lavere følsomhed sammenlignet med cytometre og potentielle problemer med den optiske tæthed af målte kulturer. Ved sammenlignende analyser skal prøveeksemplarer af plade læseren normaliseres for hver brønd (f. eks. til en måling af dyrkningstætheden, der typisk tages som absorbansen ved den optiske tæthed ved 750 nm [OD750]), hvilket kan føre til unøjagtigheder for prøver, der er for tætte og/eller ikke godt blandet (f. eks. når de er tilbøjelige til at aggregere eller flokkulering).

Som en oversigt, her viser vi i detaljer principperne for at generere niveau 0 dele, efterfulgt af hierarkisk samling ved hjælp af cyanogate kit og kloning i en vektor egnet til ægteskabelige overførsel. Vi viser derefter konjugal overførselsprocessen, udvælgelse af axeniske transconjugant stammer, der udtrykker en fluorescerende markør, og efterfølgende erhvervelse af fluorescens data ved hjælp af et flow flowcytometer eller en plade læser.

Protocol

1. vektor samling ved hjælp af anlæggets MoClo og Cyanogatværktøjssæt Bemærk: før du fortsætter med vektor samling, anbefales det kraftigt, at brugerne sætter sig ind i anlæggets vektor niveau strukturer og cyanogate moclo systemer12,15. Opførelse af niveau 0 deleBemærk: niveau 0 dele kan syntetiseres som komplette vektorer eller som lineære sekvenser for montering med level 0 acceptorer (f. eks gBlocks, IDT)…

Representative Results

For at demonstrere den gyldne Gate assembly arbejdsgang, en Expression kassette blev samlet i niveau 1 position 1 (fremad) acceptor vektor (pICH47732), der indeholder følgende niveau 0 dele: promotoren af C-phycocyanin operon Pcpc560 (PC 0,005), kodnings sekvensen for eYFP (pC 0.008) og den dobbelte Terminator TrrnB (PC 0.082)12. Efter omdannelsen af samlings reaktionen blev vellykkede forsamlinger identificeret ved hjælp a…

Discussion

Golden Gate assembly har flere fordele i forhold til andre vektor montage metoder, især med hensyn til skalerbarhed20,21. Ikke desto mindre, opsætning af Golden Gate system i et laboratorium kræver tid til at udvikle et kendskab til de forskellige dele og acceptor vektor biblioteker og samlede montageprocesser. Omhyggelig planlægning er ofte nødvendig for mere komplekse samlinger eller ved udførelse af et stort antal komplekse samlinger parallelt (f. eks. a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne er taknemmelig for PHYCONET bioteknologi og biologisk Sciences Research Council (BBSRC) netværk i industriel bioteknologi og Bioenergy (NIBB) og Industrial Biotechnology innovation Center (IBioIC) for økonomisk støtte. GARG, AASO og AP anerkender støtte fra BBSRC EASTBIO-PhD-programmet (tilskudsnummer BB/M010996/1), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) ph. d.-programmet og IBioIC-BBSRC-programmet for samarbejdende Trænings partnerskab (CTP), Henholdsvis. Vi takker Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London), og Poul Eric Jensen og Julie Annemarie Zita Zedler (Københavns Universitet) for plasmid vektor og protokol bidrag og rådgivning.

Materials

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) Thermo Fisher Scientific R0404 Used in 2.1.3.
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt Sigma-Aldrich A2383 Used in Table 2.
Agar (microbiology tested) Sigma-Aldrich A1296-500g Used in 8.3.
Agarose Bioline BIO-41026 Used in 6.
Attune NxT Flow Cytometer Thermo Fisher Scientific – Used in 4.3.1.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153 Used in Table 2.
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011 Used in Table 2.
BsaI (Eco31I) Thermo Fisher Scientific ER0291 Used in Table 2.
Carbenicillin disodium VWR International A1491.0005 Used in 2.1.3.
Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates Sigma-Aldrich CLS3527 Used in 4.1.3.
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Thermo Fisher Scientific BP231-100 Used in 3.6.2.
DNeasy Plant Mini Kit Qiagen 69104 DNA extraction kit. Used in 5.
FLUOstar Omega Microplate reader BMG Labtech – Used in 4.2.2.
GeneJET Plasmid Miniprep Kit Thermo Fisher Scientific K0503 Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.
Glass beads (0.5 mm diameter) BioSpec Products 11079105 Used in 5.2.
Glycerol Thermo Fisher Scientific 10021083 Used in 2.3.1, 3.6.2.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fisher Scientific 10356553 Used in 2.1.3.
Kanamycin sulphate (Gibco) Thermo Fisher Scientific 11815-024 Used in 2.1.3.
Membrane filters (0.45 μm) MF-Millipore HAWP02500 Used in 3.3.7
Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR Greiner Bio-One 655096 Used in 4.2.1.
Monarch DNA Gel Extraction Kit New England Biolabs T1020S Used in 1.1.2.2.
Monarch PCR DNA Cleanup Kit New England Biolabs T1030 DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.
Multitron Pro incubator with LEDs Infors HT – Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.
MyTaq DNA Polymerase Bioline BIO-21108 Used in 7.1.
NanoDrop One Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W Used in 2.3.3.
One Shot TOP10 chemically competent E. coli Thermo Fisher Scientific C404010 Used in 2.1.1.
Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate) VWR International K813 Used in 4.3.2.
Q5High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0491S Used in 1.1.2.1.
Quick-Load 1 kb DNA Ladder New England Biolabs N0468S Used in Figure 4.
Screw-cap tubes (1.5 ml) Starstedt 72.692.210 Used in 3.6.3
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate VWR International J61820.06 Used in 2.1.3.
Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates Thermo Fisher Scientific 612U96 Used in 4.3.1.
T4 DNA ligase Thermo Fisher Scientific EL0011 Used in Table 2.
TissueLyser II Qiagen 85300 Bead mill. Used in 5.2.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luan, G., Lu, X. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnology Advances. 36 (2), 430-442 (2018).
  2. Madsen, M. A., Semerdzhiev, S., Amtmann, A., Tonon, T. Engineering mannitol biosynthesis in Escherichia coli and Synechococcus sp. PCC 7002 using a green algal fusion protein. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2833-2840 (2018).
  3. Menin, B., et al. Non-endogenous ketocarotenoid accumulation in engineered Synechocystis sp. PCC 6803. Physiologia Plantarum. 166 (1), 403-412 (2019).
  4. Varman, A. M., Yu, Y., You, L., Tang, Y. J. Photoautotrophic production of D-lactic acid in an engineered cyanobacterium. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-8 (2013).
  5. Vavitsas, K., et al. Responses of Synechocystis sp. PCC 6803 to heterologous biosynthetic pathways. Microbial Cell Factories. 16, 140 (2017).
  6. Yang, G., et al. Photosynthetic production of sunscreen shinorine using an engineered cyanobacterium. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 664-671 (2018).
  7. Nielsen, A. Z., et al. Extending the biosynthetic repertoires of cyanobacteria and chloroplasts. Plant Journal. 87 (1), 87-102 (2016).
  8. Nielsen, J., Keasling, J. D. Engineering cellular metabolism. Cell. 164 (6), 1185-1197 (2016).
  9. Stensjö, K., Vavitsas, K., Tyystjärvi, T. Harnessing transcription for bioproduction in cyanobacteria. Physiologia Plantarum. 162 (2), 148-155 (2018).
  10. Santos-Merino, M., Singh, A. K., Ducat, D. C. New applications of synthetic biology tools for cyanobacterial metabolic engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-24 (2019).
  11. Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. Journal of Visualized Experiments. 111, e54001 (2016).
  12. Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
  13. Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile golden-gate framework towards universal DNA assembly. PLoS ONE. 13 (1), 1-18 (2018).
  14. Crozet, P., et al. Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo toolkit enabling synthetic biology in the microalga Chlamydomonas reinhardtii. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2074-2086 (2018).
  15. Engler, C., et al. A Golden Gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
  16. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  17. Pollak, B., et al. Loop assembly: a simple and open system for recursive fabrication of DNA circuits. New Phytologist. 222 (1), 628-640 (2019).
  18. Werner, S., Engler, C., Weber, E., Gruetzner, R., Marillonnet, S. Fast track assembly of multigene constructs using golden gate cloning and the MoClo system. Bioengineered Bugs. 3 (1), 38-43 (2012).
  19. Patron, N. J., et al. Standards for plant synthetic biology: a common syntax for exchange of DNA parts. New Phytologist. 208 (1), 13-19 (2015).
  20. Chao, R., Mishra, S., Si, T., Zhao, H. Engineering biological systems using automated biofoundries. Metabolic Engineering. 42, 98-108 (2017).
  21. Chambers, S., Kitney, R., Freemont, P. The Foundry: the DNA synthesis and construction Foundry at Imperial College. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 687-688 (2016).
  22. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  23. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Rare codon content affects the solubility of recombinant proteins in a codon bias-adjusted Escherichia coli strain. Microbial Cell Factories. 8, 1-9 (2009).
  24. Cambray, G., et al. Measurement and modeling of intrinsic transcription terminators. Nucleic Acids Research. 41 (9), 5139-5148 (2013).
  25. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nature Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  26. Münch, R., et al. Virtual Footprint and PRODORIC: An integrative framework for regulon prediction in prokaryotes. Bioinformatics. 21 (22), 4187-4189 (2005).
  27. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nature Biotechnology. 27 (10), 946-950 (2009).
  28. Englund, E., Liang, F., Lindberg, P. Evaluation of promoters and ribosome binding sites for biotechnological applications in the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Scientific Reports. 6, 36640 (2016).
  29. Heidorn, T., et al. Synthetic biology in cyanobacteria engineering and analyzing novel functions. Methods in Enzymology. 497, 539-579 (2011).
  30. Thiel, K., et al. Translation efficiency of heterologous proteins is significantly affected by the genetic context of RBS sequences in engineered cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbial Cell Factories. 17, 34 (2018).
  31. Liu, Q., Schumacher, J., Wan, X., Lou, C., Wang, B. Orthogonality and burdens of heterologous and gate gene circuits in E. coli. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 553-564 (2018).
  32. Ferreira, E. A., et al. Expanding the toolbox for Synechocystis sp. PCC 6803: Validation of replicative vectors and characterization of a novel set of promoters. Synthetic Biology. (August), 1-39 (2018).
  33. Liang, F., Lindblad, P. Synechocystis PCC 6803 overexpressing RuBisCO grow faster with increased photosynthesis. Metabolic Engineering Communications. 4, 29-36 (2017).
  34. Taton, A., et al. Broad-host-range vector system for synthetic biology and biotechnology in cyanobacteria. Nucleic Acids Research. 42 (17), e136 (2014).
  35. Elhai, J., Wolk, C. P. Conjugal transfer of DNA to cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167 (1984), 747-754 (1988).
  36. Gormley, E. P., Davies, J. Transfer of plasmid RSF1010 by conjugation from Escherichia coli to Streptomyces lividans and Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 173 (21), 6705-6708 (1991).
  37. Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P., Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a synthetic biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2577-2593 (2010).
  38. Huang, H. H., Lindblad, P. Wide-dynamic-range promoters engineered for cyanobacteria. Journal of Biological Engineering. 7, 10 (2013).
  39. Li, S., Sun, T., Xu, C., Chen, L., Zhang, W. Development and optimization of genetic toolboxes for a fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Metabolic Engineering. 48, 163-174 (2018).
  40. Pansegrau, W., Balzer, D., Kruft, V., Lurz, R., Lanka, E. In vitro assembly of relaxosomes at the transfer origin of plasmid RP4. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 87 (17), 6555-6559 (1990).
  41. Song, K., Tan, X., Liang, Y., Lu, X. The potential of Synechococcus elongatus UTEX 2973 for sugar feedstock production. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (18), 7865-7875 (2016).
  42. Waters, V. L., Guiney, D. G. Processes at the nick region link conjugation, T-DNA transfer and rolling circle replication. Molecular Microbiology. 9 (6), 1123-1130 (1993).
  43. Elhai, J., Vepritskiy, A., Muro-Pastor, A. M., Flores, E., Wolk, C. P. Reduction of conjugal transfer efficiency by three restriction activities of Anabaena sp. strain PCC 7120. Journal of Bacteriology. 179 (6), 1998-2005 (1997).
  44. Silva-Rocha, R., et al. The Standard European Vector Architecture (SEVA): A coherent platform for the analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes. Nucleic Acids Research. 41 (D1), D666-D675 (2013).
  45. Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
  46. Masukawa, H., Inoue, K., Sakurai, H., Wolk, C. P., Hausinger, R. P. Site-directed mutagenesis of the Anabaena sp. strain PCC 7120 nitrogenase active site to increase photobiological hydrogen production. Applied and Environmental Microbiology. 76 (20), 6741-6750 (2010).
  47. Yu, J., et al. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific Reports. 5 (1), 8132 (2015).
  48. Ungerer, J., Wendt, K. E., Hendry, J. I., Maranas, C. D., Pakrasi, H. B. Comparative genomics reveals the molecular determinants of rapid growth of the cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 115 (50), E11761-E11770 (2018).
  49. Lepesteur, M., Martin, J. M., Fleury, A. A comparative study of different preservation methods for phytoplankton cell analysis by flow cytometry. Marine Ecology Progress Series. 93 (1-2), 55-63 (1993).
  50. Day, J. G. Cryopreservation of cyanobacteria. Cyanobacteria: An Economic perspective. , 319-327 (2014).
  51. Zhou, J., et al. Discovery of a super-strong promoter enables efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria. Scientific Reports. 4, 4500 (2014).
  52. Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
  53. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66, 174-176 (2006).
  54. Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6, 38828 (2016).
  55. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).

Tags

Genetic ModificationCyanobacteriaConjugationCyanoGateModular CloningSynthetic BiologyRenewable BiotechnologyTriparental MatingTransformationSynechocystisSynechococcusE. ColiHelper StrainPlasmids
check_url/60451?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gale, G. A. R., Schiavon Osorio, A. A., Puzorjov, A., Wang, B., McCormick, A. J. Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit. J. Vis. Exp. (152), e60451, doi:10.3791/60451 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image