השינוי הגנטי של הקיאובקטריה באמצעות הקוניוגציה באמצעות ערכת השכפול המודולרי של ציאנוגייט
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר כיצד אני) להרכיב וקטור שכפול עצמי באמצעות ערכת השכפול שיבוט מודולרי ציאנוגייט, ii) להציג את הווקטור לתוך מארח cyanobacterial על ידי הקונקטורים, ו iii) לאפיין את הזנים של הציטוחיידקים הטרנסגניים באמצעות קורא צלחת או לזרום cy, לנסות.
Abstract
כחוליות הן קבוצה מגוונת של אורגניזמים פוטוסינתטיים prokaryotic שניתן לשנות גנטית עבור ייצור מתחדשת של סחורות תעשייתיות שימושי. ההתפתחויות האחרונות בביולוגיה סינתטית הובילו לפיתוח של כמה ערכות כלים שיבוט כגון ציאנוגייט, מערכת סטנדרטית שיבוט מודולרי לבניית וקטורים פלביניים עבור שינוי או העברה הזוגיות לתוך כחוליות. כאן אנו מתווה שיטה מפורטת להרכבת וקטור שכפול עצמי (למשל, נשיאת מחסנית ביטוי של סמן פלורסנט) והעברה בת הזוג של הווקטור לתוך זנים cyanobacterial של sy, pcc 6803 או Synechocystis elongatus utex 2973. בנוסף, אנו לתאר כיצד לאפיין את הביצועים של חלק גנטי (למשל, מיזם) באמצעות קורא צלחת או זרימת cy, לנסות.
Introduction
כחוליות הautotrophic בקטריה שיכולה לשמש לביוסינתזה של מגוון רחב של מוצרים מטבוליים בעלי ערך גבוה והטרוולוגי,1,2,3,4,5, . שישה מטרים מכשולים מספר עדיין צריך להיות להתגבר כדי להרחיב את הכדאיות המסחרית שלהם, בעיקר, את התשואות העניים יחסית לעומת heterotrophic bio-פלטפורמות (למשל, Esהכלאיים קולי ושמרים)7. ההרחבה האחרונה של כלים הנדסה גנטית זמין וספיגת הפרדיגמה של ביולוגיה סינתטי במחקר cyanobacterial הוא עוזר להתגבר על אתגרים כאלה ועוד לפתח cyanחיידקים יעילים ביוקוסיטיות יעילות8, 9,10.
הגישות העיקריות להצגת ה-DNA לתוך הקיאובקטריה הם טרנספורמציה, היווצרות ואלקטרופורציה. הווקטורים שהועברו לציטואובקטריה על ידי טרנספורמציה או אלקטרופורציה הם “התאבדות” וקטורים (כלומר, וקטורים אינטגרטיבית המקלים על שילוב הומולוגי), בעוד שניתן להעביר וקטורים שמשכפלת את עצמם לציאנקטריה על ידי שינוי צורה, קוניוגציה או אלקטרופורציה. עבור הראשון, פרוטוקול זמין עבור מינים הנדסה מודל מאפשר שינוי טבעי11. לאחרונה, שיבוט מודולרי (MoClo) ערכת כלים עבור כחוליות הנקרא ציאנוגייט פותחה כי מעסיקה שיטת הרכבה סטנדרטית של שער הזהב להנדסה באמצעות שינוי טבעי, אלקטרופורציה או הקוניוגציה12.
שיטות הרכבה מסוג שער הזהב הפכו לפופולריות יותר ויותר בשנים האחרונות, ותקני הרכבה וספריות חלק זמינים כעת עבור מגוון של אורגניזמים13,14,15,16 ,בן 17 שער הזהב משתמש באנזימים של הגבלת IIS (לדוגמה, BsaI, Bsai, Bsb, BtgZI ו-AarI) וסידרה של קבלה והיתקעות ייחודיות כדי להקל על הרכבה הירארכית כיוונית של רצפים מרובים בתגובת הרכבה מסוג “סיר אחד”. הקלד אנזימי הגבלת IIS מזהים רצף אסימטרי ייחודי וחותכים מרחק מוגדר מאתרי הזיהוי שלהם כדי ליצור התנדנד, גזור “בסוף דביק” (בדרך כלל 4 נוקלאוטיד [NT] overhang), אשר ניתן לנצל לאחר מכן הכונן DNA הזמנת תגובותהאסיפה 15,18. פעולה זו הפכה את ההתפתחות של ספריות גדולות של חלקים מודולריים ברמה 0 (למשל, היזמים, לפתוח מסגרות קריאה ומחסלים) המוגדרים על ידי תחביר משותף, כמו התקן פיטולבנים19. לאחר מכן, חלקים ברמה 0 יכולים להיות מורכבים בקלות לתוך קלטות ביטוי רמה 1, בעקבות הרכבות יותר מורכבות בסדר גבוה (g., ביטויים multigene בנייה) ניתן לבנות וקטור קבלה של בחירה12,15. יתרון מרכזי של טכניקות הרכבה מסוג שער הזהב הוא היכולת שלהם לאוטומציה במתקני תפוקה גבוהה, כגון שירותי דנ א20,21, אשר יכול לאפשר בדיקה של עיצובים ניסיוניים מורכבים ש לא ניתן להשיג בקלות על ידי עבודה ידנית.
כלציאנו-גייט בונה על מערכת. המפעל הוקמה12,15 כדי לשלב חלק חדש לתוך ציאנוגייט, על רצף החלקים להיות ממושמע, כלומר, אתרי זיהוי “לא חוקיים עבור BsaI ו-Bsai חייבים להיות מוסרים. במקרה של קידוד חלק עבור מסגרת קריאה פתוחה (כלומר, רצף קידוד, תקליטורים), אתרי הכרה יכולים להיות מופרת על ידי יצירת מוטציות נרדף ברצף (כלומר, שינוי העין לחלופה המקודד עבור אותו שאריות חומצות אמינו). זה יכול להיות מושגת על ידי מגוון רחב של גישות, החל סינתזה של DNA לתגובת שרשרת פולימראז (PCR) מבוססי הגברה אסטרטגיות כגון מכלול גיבסון22. בהתאם למארח הביטוי המשמש, יש לנקוט כדי למנוע את המבוא של משתמשים נדירים שיכולים לעכב את היעילות של תרגום23. הסרת אתרי זיהוי ברצפים של יזם ושליחות קטלנית היא בדרך כלל מאמץ לגולש, מאחר ששינויים עלולים להשפיע על הפונקציה וייתכן שהחלק לא יפעל כמצופה. לדוגמה, שינויים באתרי האיגוד של גורמי הכריכה או באתר המחייב הריבוחלק בתוך מקדם יכולים לשנות כוח ותגובתיות לאינדוקציה/דיכוי. כמו כן, שינויים בתכונות מבניים שליחות קטלנית (g., הגזע העשיר GC, לולאה ו פולי-U הזנב) עשוי לשנות את יעילות הפסקת וביטוי גן ההשפעה24,25. למרות מספר משאבים מקוונים זמינים כדי לנבא את הפעילות של היזם ואת רצפי שליחות קטלנית, ולהודיע אם מוטציה המוצע ישפיע על ביצועים26,27, כלים אלה הם לעתים קרובות מנבא עניים של ביצועים בקיאנקטריה28,29,30... ככזה, באפיון vivo של חלקים שהשתנו עדיין מומלץ לאשר פעילות. כדי לסייע עם שיבוט של רצפים הסרבן, כוללות כולל העתק נמוך שיבוט קבלת וקטור מבוסס על הווקטור biobrick pSB4K512,16,31. יתר על כן, “עיצוב ובנייה” הפורטל זמין דרך בית היציקה של אדינבורו הגנום כדי לעזור עם עיצוב וקטורי (dab.genomefoundry.org). לבסוף, והכי חשוב, ציאנוגייט כוללת שני עיצובים וקטוריים ברמה 2 (שווה ערך לקבלת וקטורים ברמה 3)15 עבור החדרת דנ א לתוך כחוליות באמצעות וקטורים התאבדות, או וקטורים רחבים של טווח המארח המסוגל לשכפול עצמי בכמה מינים של cyanobacterial32,33,34.
כאן נתמקד בתיאור פרוטוקול ליצירת וקטורים ברמה שכפול עצמי והשינוי הגנטי של Syelongatus לוצילף pcc 6803 ו Synechocystis Utex 2973 (sy לוצילף pcc 6803 ו -S. elongatus Utex 2973 להלן) על ידי הקוניוגציה (המכונה גם ההזדווגות tri-הורים). העברת הזוגיות של דנ א בין התאים החיידקיים הוא תהליך מתואר היטב, כבר בשימוש בעבר עבור מינים הנדסה cyanobacterial, בפרט אלה שאינם מוכשרים באופן טבעי, כגון S. elongatus utex 297335, 36,37,38,39,40,41. בקצרה, תרבויות cyanobacterial הם מודבטים עם הזן E. coli נושאת את וקטור להיות הועבר (“מטענים” וקטור) ו וקטורים (או באותו מאמץ E. coli או בזנים נוספים) כדי לאפשר בניינים (“מגייס” ו “עוזר” וקטורים). ארבעה תנאים מרכזיים נדרשים עבור העברת הזוגיות להתרחש: 1) קשר ישיר בין התאים המעורבים בהעברת ה-DNA, 2) וקטור המטען חייב להיות תואם עם מערכת הקוניוגציה (כלומר, היא חייבת להכיל מקור העברה מתאים (אורית), ידוע גם בשם bom (בסיס של ניידות) האתר), 3) בדיקת דנ א בחלבון (g., מקודד על ידי הגן המאפיה ) כי הניקס ב אורית ליזום העברה אחת תקוע של ה-dna לתוך cyanקוביום חייב להיות נוכח ומבוטא מן המטען או מסייע וקטורים, ו -4) ה-DNA המועבר לא צריך להיהרס ב cyanobacterium הנמען (כלומר, חייב להיות עמיד בפני השפלה על ידי, למשל, הגבלה endonuclease פעילות)35,42. עבור וקטור המטען להמשיך, מקור השכפול חייב להיות תואם עם cyanקוביום הנמען כדי לאפשר שכפול עצמי והתפשטות לתוך מחלקת תאים ביתי הדואר. כדי לסייע עם תנאים 3 ו-4, מספר וקטורים מסייעים זמינים דרך Addgene ומקורות מסחריים אחרים המקודדים עבור המאפיה , כמו גם מתילסים מספר להגן מפני העין המקורית של cyanobacterium מארח43. בפרוטוקול זה הונחה הקוניוגציה על ידי זן MC1061 E. coli הנושא וקטורים מpRK24 (www. addgeneorg/51950) וpRL528 (www.addgene.org/58495), בהתאמה. הטיפול חייב להילקח בעת בחירת וקטורים לשמש להעברת הזוגיות. לדוגמה, בערכת ציאנושער שכפול המטען העצמי וקטור pPMQAK1-T מקודד עבור חלבון המאפיה12. עם זאת, pSEVA421-T אינו44, וככזה, האספסוף חייב להתבטא מתוך וקטור עוזר מתאים. הווקטורים המשמשים צריכים להיות גם מתאימים לאורגניזם היעד. לדוגמה, העברת הזוגיות יעילה ב- אננינה SP. pcc 7120 דורש וקטור עוזר המגן על וקטור מגייס נגד העיכול (למשל, pRL623, אשר מקודד עבור שלושה מתילסים Avaim, Eco47iiM ו Ecot22iM)45, 46.
בפרוטוקול זה אנו עוד לתאר כיצד לאפיין את הביצועים של חלקים (כלומר, היזמים) עם סמן פלורסנט באמצעות קורא צלחת או cytometer זרימה. הציטומטרים זורמים מסוגלים למדוד את הקרינה הפלואורסצנטית על בסיס תא בודד עבור אוכלוסיה גדולה. יתר על כן, cytomטומטריים זרימה לאפשר למשתמשים “שער” את הנתונים הנרכשים ולהסיר רעשי רקע (למשל, מחומר חלקיקי בתרבות או זיהום). לעומת זאת, קוראי צלחות רוכשים מדידה בלתי מצטברת של כמות תרבותית מסוימת, בדרך כלל במספר בארות שכפול. יתרונות מרכזיים של קוראי צלחות על cytomטומטריים כוללים את העלות הנמוכה יותר, זמינות גבוהה יותר ובדרך כלל אין דרישה עבור תוכנות מומחה עבור ניתוח נתונים במורד. החסרונות העיקריים של קוראי צלחות הם רגישות נמוכה יחסית לעומת cytomטומטריים ובעיות פוטנציאליות עם צפיפות אופטית של תרבויות מדודות. עבור ניתוחים השוואתיים, יש לכלול בדוגמאות של קורא הצלחות באופן שטוח עבור כל באר (לדוגמה, למדידה של צפיפות התרבות, הנלקחת בדרך כלל כספיגת החומר בצפיפות האופטית ב-750 ננומטר [OD750]), שעלולה להוביל לאי אי-דיוקים עבור דגימות שאינן צפוף ו/או לא מעורבב היטב (למשל, כאשר מועדים לצבירה או לחיסון).
כסקירה, כאן אנו להדגים בפירוט את העקרונות של יצירת רמה 0 חלקים, ואחריו הרכבה הירארכית באמצעות ערכת ציאנוגייט ושיבוט לתוך וקטור מתאים להעברת הזוגיות. לאחר מכן אנו להדגים את תהליך העברת הזוגיות, מבחר של הזנים הטרנסמעית של היקום הבטא סמן פלורסנט, ובעקבות הרכישה של נתונים פלואורסצנטית באמצעות cytometer זרם או קורא צלחת.
Protocol
Representative Results
Discussion
להרכבת שער הזהב יש מספר יתרונות בהשוואה לשיטות הרכבה וקטוריות אחרות, במיוחד במונחים של מדרגיות של20,21. עם זאת, הקמת מערכת שער הזהב במעבדה דורשת זמן לפתח היכרות עם החלקים השונים ולקבלה של ספריות וקטוריות ותהליכי הרכבה כוללים. תכנון קפדני נדרש לעתים קרובות עבו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים אסירי תודה על מועצת המחקר של הביוטכנולוגיה PHYCONET ומדעי הביולוגיה (BBSRC) רשת ביוטכנולוגיה תעשייתית, Bioenergy (NIBB) ומרכז החדשנות ביוטכנולוגיה (IBioIC) לתמיכה כספית. GARG, AASO ו AP הענקת מימון תמיכה מן התוכנית המקצועית של ה-BBSRC מקרה PhD (הענק מספר BB/M010996/1), Consejo הלאומי דה Ciencia y Tecnología (CONSEJO) PhD תוכנית, ואת IBioIC-BBSRC שותפות הדרכה (CTP) התוכנית PhD, בהתאמה. אנו מודים לקונרד מולקו (המלכה מרי אוניברסיטת לונדון) ו פול אריק ג’נסן וג אנמרי זיטה זדלר (אוניברסיטת קופנהגן) לתרומות וקטורים בפרוטוקולים וקטוריים וייעוץ.
Materials
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Thermo Fisher Scientific | R0404 | Used in 2.1.3. |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt | Sigma-Aldrich | A2383 | Used in Table 2. |
| Agar (microbiology tested) | Sigma-Aldrich | A1296-500g | Used in 8.3. |
| Agarose | Bioline | BIO-41026 | Used in 6. |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | – | Used in 4.3.1. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Used in Table 2. |
| BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | Used in Table 2. |
| BsaI (Eco31I) | Thermo Fisher Scientific | ER0291 | Used in Table 2. |
| Carbenicillin disodium | VWR International | A1491.0005 | Used in 2.1.3. |
| Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Used in 4.1.3. |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | Used in 3.6.2. |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | DNA extraction kit. Used in 5. |
| FLUOstar Omega Microplate reader | BMG Labtech | – | Used in 4.2.2. |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2. |
| Glass beads (0.5 mm diameter) | BioSpec Products | 11079105 | Used in 5.2. |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 10021083 | Used in 2.3.1, 3.6.2. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | 10356553 | Used in 2.1.3. |
| Kanamycin sulphate (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11815-024 | Used in 2.1.3. |
| Membrane filters (0.45 μm) | MF-Millipore | HAWP02500 | Used in 3.3.7 |
| Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR | Greiner Bio-One | 655096 | Used in 4.2.1. |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020S | Used in 1.1.2.2. |
| Monarch PCR DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | DNA purification kit. Used in 1.1.2.3. |
| Multitron Pro incubator with LEDs | Infors HT | – | Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4. |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21108 | Used in 7.1. |
| NanoDrop One | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used in 2.3.3. |
| One Shot TOP10 chemically competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C404010 | Used in 2.1.1. |
| Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate) | VWR International | K813 | Used in 4.3.2. |
| Q5High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491S | Used in 1.1.2.1. |
| Quick-Load 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N0468S | Used in Figure 4. |
| Screw-cap tubes (1.5 ml) | Starstedt | 72.692.210 | Used in 3.6.3 |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | VWR International | J61820.06 | Used in 2.1.3. |
| Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 612U96 | Used in 4.3.1. |
| T4 DNA ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | Used in Table 2. |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Bead mill. Used in 5.2. |
References
- Luan, G., Lu, X. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnology Advances. 36 (2), 430-442 (2018).
- Madsen, M. A., Semerdzhiev, S., Amtmann, A., Tonon, T. Engineering mannitol biosynthesis in Escherichia coli and Synechococcus sp. PCC 7002 using a green algal fusion protein. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2833-2840 (2018).
- Menin, B., et al. Non-endogenous ketocarotenoid accumulation in engineered Synechocystis sp. PCC 6803. Physiologia Plantarum. 166 (1), 403-412 (2019).
- Varman, A. M., Yu, Y., You, L., Tang, Y. J. Photoautotrophic production of D-lactic acid in an engineered cyanobacterium. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-8 (2013).
- Vavitsas, K., et al. Responses of Synechocystis sp. PCC 6803 to heterologous biosynthetic pathways. Microbial Cell Factories. 16, 140 (2017).
- Yang, G., et al. Photosynthetic production of sunscreen shinorine using an engineered cyanobacterium. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 664-671 (2018).
- Nielsen, A. Z., et al. Extending the biosynthetic repertoires of cyanobacteria and chloroplasts. Plant Journal. 87 (1), 87-102 (2016).
- Nielsen, J., Keasling, J. D. Engineering cellular metabolism. Cell. 164 (6), 1185-1197 (2016).
- Stensjö, K., Vavitsas, K., Tyystjärvi, T. Harnessing transcription for bioproduction in cyanobacteria. Physiologia Plantarum. 162 (2), 148-155 (2018).
- Santos-Merino, M., Singh, A. K., Ducat, D. C. New applications of synthetic biology tools for cyanobacterial metabolic engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-24 (2019).
- Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. Journal of Visualized Experiments. 111, e54001 (2016).
- Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
- Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile golden-gate framework towards universal DNA assembly. PLoS ONE. 13 (1), 1-18 (2018).
- Crozet, P., et al. Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo toolkit enabling synthetic biology in the microalga Chlamydomonas reinhardtii. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2074-2086 (2018).
- Engler, C., et al. A Golden Gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Pollak, B., et al. Loop assembly: a simple and open system for recursive fabrication of DNA circuits. New Phytologist. 222 (1), 628-640 (2019).
- Werner, S., Engler, C., Weber, E., Gruetzner, R., Marillonnet, S. Fast track assembly of multigene constructs using golden gate cloning and the MoClo system. Bioengineered Bugs. 3 (1), 38-43 (2012).
- Patron, N. J., et al. Standards for plant synthetic biology: a common syntax for exchange of DNA parts. New Phytologist. 208 (1), 13-19 (2015).
- Chao, R., Mishra, S., Si, T., Zhao, H. Engineering biological systems using automated biofoundries. Metabolic Engineering. 42, 98-108 (2017).
- Chambers, S., Kitney, R., Freemont, P. The Foundry: the DNA synthesis and construction Foundry at Imperial College. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 687-688 (2016).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Rare codon content affects the solubility of recombinant proteins in a codon bias-adjusted Escherichia coli strain. Microbial Cell Factories. 8, 1-9 (2009).
- Cambray, G., et al. Measurement and modeling of intrinsic transcription terminators. Nucleic Acids Research. 41 (9), 5139-5148 (2013).
- Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nature Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
- Münch, R., et al. Virtual Footprint and PRODORIC: An integrative framework for regulon prediction in prokaryotes. Bioinformatics. 21 (22), 4187-4189 (2005).
- Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nature Biotechnology. 27 (10), 946-950 (2009).
- Englund, E., Liang, F., Lindberg, P. Evaluation of promoters and ribosome binding sites for biotechnological applications in the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Scientific Reports. 6, 36640 (2016).
- Heidorn, T., et al. Synthetic biology in cyanobacteria engineering and analyzing novel functions. Methods in Enzymology. 497, 539-579 (2011).
- Thiel, K., et al. Translation efficiency of heterologous proteins is significantly affected by the genetic context of RBS sequences in engineered cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbial Cell Factories. 17, 34 (2018).
- Liu, Q., Schumacher, J., Wan, X., Lou, C., Wang, B. Orthogonality and burdens of heterologous and gate gene circuits in E. coli. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 553-564 (2018).
- Ferreira, E. A., et al. Expanding the toolbox for Synechocystis sp. PCC 6803: Validation of replicative vectors and characterization of a novel set of promoters. Synthetic Biology. (August), 1-39 (2018).
- Liang, F., Lindblad, P. Synechocystis PCC 6803 overexpressing RuBisCO grow faster with increased photosynthesis. Metabolic Engineering Communications. 4, 29-36 (2017).
- Taton, A., et al. Broad-host-range vector system for synthetic biology and biotechnology in cyanobacteria. Nucleic Acids Research. 42 (17), e136 (2014).
- Elhai, J., Wolk, C. P. Conjugal transfer of DNA to cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167 (1984), 747-754 (1988).
- Gormley, E. P., Davies, J. Transfer of plasmid RSF1010 by conjugation from Escherichia coli to Streptomyces lividans and Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 173 (21), 6705-6708 (1991).
- Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P., Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a synthetic biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2577-2593 (2010).
- Huang, H. H., Lindblad, P. Wide-dynamic-range promoters engineered for cyanobacteria. Journal of Biological Engineering. 7, 10 (2013).
- Li, S., Sun, T., Xu, C., Chen, L., Zhang, W. Development and optimization of genetic toolboxes for a fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Metabolic Engineering. 48, 163-174 (2018).
- Pansegrau, W., Balzer, D., Kruft, V., Lurz, R., Lanka, E. In vitro assembly of relaxosomes at the transfer origin of plasmid RP4. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 87 (17), 6555-6559 (1990).
- Song, K., Tan, X., Liang, Y., Lu, X. The potential of Synechococcus elongatus UTEX 2973 for sugar feedstock production. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (18), 7865-7875 (2016).
- Waters, V. L., Guiney, D. G. Processes at the nick region link conjugation, T-DNA transfer and rolling circle replication. Molecular Microbiology. 9 (6), 1123-1130 (1993).
- Elhai, J., Vepritskiy, A., Muro-Pastor, A. M., Flores, E., Wolk, C. P. Reduction of conjugal transfer efficiency by three restriction activities of Anabaena sp. strain PCC 7120. Journal of Bacteriology. 179 (6), 1998-2005 (1997).
- Silva-Rocha, R., et al. The Standard European Vector Architecture (SEVA): A coherent platform for the analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes. Nucleic Acids Research. 41 (D1), D666-D675 (2013).
- Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
- Masukawa, H., Inoue, K., Sakurai, H., Wolk, C. P., Hausinger, R. P. Site-directed mutagenesis of the Anabaena sp. strain PCC 7120 nitrogenase active site to increase photobiological hydrogen production. Applied and Environmental Microbiology. 76 (20), 6741-6750 (2010).
- Yu, J., et al. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific Reports. 5 (1), 8132 (2015).
- Ungerer, J., Wendt, K. E., Hendry, J. I., Maranas, C. D., Pakrasi, H. B. Comparative genomics reveals the molecular determinants of rapid growth of the cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 115 (50), E11761-E11770 (2018).
- Lepesteur, M., Martin, J. M., Fleury, A. A comparative study of different preservation methods for phytoplankton cell analysis by flow cytometry. Marine Ecology Progress Series. 93 (1-2), 55-63 (1993).
- Day, J. G. Cryopreservation of cyanobacteria. Cyanobacteria: An Economic perspective. , 319-327 (2014).
- Zhou, J., et al. Discovery of a super-strong promoter enables efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria. Scientific Reports. 4, 4500 (2014).
- Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
- Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66, 174-176 (2006).
- Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6, 38828 (2016).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
