Genetische Modifikation von Cyanobakterien durch Konjugation mit dem CyanoGate Modular Cloning Toolkit
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das beschreibt, wie i) einen sich selbst replizierenden Vektor mithilfe des modularen Klon-Toolkits CyanoGate zusammenstellen kann, ii) den Vektor durch Konjugation in einen cyanobakteriellen Wirt einführt und iii) transgene Cyanobakterienstämme mit einem Plattenleser oder Durchflusszytometrie.
Abstract
Cyanobakterien sind eine vielfältige Gruppe von prokaryotischen photosynthetischen Organismen, die für die nachwachsende Produktion nützlicher Industrieller verwendet werden können. Jüngste Fortschritte in der synthetischen Biologie haben zur Entwicklung mehrerer Klon-Toolkits wie CyanoGate geführt, einem standardisierten modularen Klonsystem zum Aufbau von Plasmidvektoren für die nachfolgende Transformation oder die eheliche Übertragung in Cyanobakterien. Hier skizzieren wir eine detaillierte Methode zur Zusammenstellung eines sich selbst replizierenden Vektors (z.B. mit einer fluoreszierenden Markerexpressionskassette) und der wechselförmigen Übertragung des Vektors in die cyanobakteriellen Stämme Synechocystis sp. PCC 6803 oder Synechococcus Elongatus UTEX 2973. Darüber hinaus beschreiben wir, wie die Leistung eines genetischen Teils (z. B. eines Promotors) mit einem Plattenleser oder einer Durchflusszytometrie charakterisiert werden kann.
Introduction
Cyanobakterien sind autotrophe Bakterien, die für die Biosynthese einer Vielzahl von natürlichen und heterologen hochwertigenStoffwechselprodukten1,2,3,4,5, 6. Es müssen noch einige Hürden überwunden werden, um ihre wirtschaftliche Lebensfähigkeit zu erhöhen, vor allem die relativ geringen Erträge im Vergleich zu heterotrophen Bioplattformen (z. B. Escherichia coli und Hefe)7. Die jüngste Erweiterung der verfügbaren gentechnischen Werkzeuge und die Übernahme des synthetischen Biologie-Paradigmas in der zyanobakteriellen Forschung trägt dazu bei, solche Herausforderungen zu überwinden und Cyanobakterien als effiziente Biofabriken weiterzuentwickeln8, 9,10.
Die wichtigsten Ansätze zur Einführung von DNA in Cyanobakterien sind Transformation, Konjugation und Elektroporation. Die DurchTransformation oder Elektroporation auf Cyanobakterien übertragenen Vektoren sind “Selbstmordvektoren” (d. h. integrative Vektoren, die eine homologe Rekombination erleichtern), während sich selbst replizierende Vektoren durch Transformation, Konjugation oder Elektroporation. Für erstere steht ein Protokoll für technische Modellarten zur Verfügung, die für die natürliche Transformation geeignet sind11. In jüngerer Zeit wurde ein modulares Klonen (MoClo) Toolkit für Cyanobakterien namens CyanoGate entwickelt, das ein standardisiertes Golden Gate Vektormontageverfahren für die Konstruktion mit natürlicher Transformation, Elektroporation oder Konjugation12verwendet.
Golden Gate-Typ Montagetechniken sind in den letzten Jahren immer beliebter geworden, und Montagestandards und Teilebibliotheken sind jetzt für eine Vielzahl von Organismenverfügbar 13,14,15,16 ,17. Golden Gate verwendet Typ IIS-Restriktionsenzyme (z. B. BsaI, BpiI, BsmBI, BtgZI und AarI) und einen Anzug von Akzeptoren und einzigartigen Überhängen, um die richtungsweisende hierarchische Montage mehrerer Sequenzen in einer “One Pot”-Montagereaktion zu erleichtern. Typ-IIS-Restriktionsenzyme erkennen eine eindeutige asymmetrische Sequenz und schneiden einen definierten Abstand von ihren Erkennungsstellen, um einen gestaffelten “klebrigen Ende”-Schnitt (typischerweise ein 4-Nukleotid-Überhang) zu erzeugen, der anschließend genutzt werden kann, um geordnete DNA anzutreiben. Montagereaktionen15,18. Dies hat die Entwicklung großer Bibliotheken modularer Level 0-Teile (z. B. Promoter, offene Leserahmen und Terminatoren) ermöglicht, die durch eine gemeinsame Syntax definiert sind, wie z. B. der PhytoBricks-Standard19. Teile der Ebene 0 können dann leicht zu Expressionkassetten der Ebene 1 zusammengebaut werden, woraufhin komplexere Baugruppen höherer Ordnung (z. B. Multigenexpressionskonstrukte) in einem Akzeptorvektor der Wahl12,15erstellt werden können. Ein wesentlicher Vorteil der Montagetechniken vom Typ Golden Gate ist ihre Automatisierung simperbar in Hochdurchsatzanlagen wie DNA-Gießereien20,21, die das Testen komplexer experimenteller Konstruktionen ermöglichen können, die nicht leicht durch manuelle Arbeit erreicht werden können.
CyanoGate baut auf dem etablierten Plant MoClo System12,15auf. Um ein neues Teil in CyanoGate zu integrieren, muss zunächst die Teilesequenz domestiziert werden, d.h. “illegale” Erkennungsseiten für BsaI und BpiI müssen entfernt werden. Im Falle eines Teils, das für einen offenen Leserahmen kodiert (d. h. eine Codierungssequenz, CDS), können Erkennungsstellen gestört werden, indem synonyme Mutationen in der Sequenz erzeugt werden (d. h. ein Codon in eine Alternative umwandelt, die für denselben Aminosäurerest kodiert). Dies kann durch eine Vielzahl von Ansätzen erreicht werden, von der DNA-Synthese bis zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Amplifikations-basierte Strategien wie Gibson-Montage22. Je nach verwendeter Expression des Hosts sollte darauf geachtet werden, die Einführung seltener Codons zu vermeiden, die die Effizienz der Übersetzung23hemmen könnten. Das Entfernen von Erkennungsstellen in Promoter- und Terminatorsequenzen ist in der Regel ein riskanteres Unterfangen, da Änderungen die Funktion beeinträchtigen können und das Teil möglicherweise nicht wie erwartet funktioniert. Beispielsweise können Änderungen an vermeintlichen Transkriptionsfaktorbindungsstellen oder der Ribosombindungsstelle innerhalb eines Promotors die Stärke und Reaktionsfähigkeit auf Induktion/Repression verändern. Ebenso können Änderungen an wichtigen Terminatorstrukturmerkmalen (z. B. GC-Rich-Stamm, Schleife und Poly-U-Schwanz) die Beendigungseffizienz ändern und die Genexpression24,25effektieren. Obwohl mehrere Online-Ressourcen zur Verfügung stehen, um die Aktivität von Promotor- und Terminatorsequenzen vorherzusagen und zu informieren, ob eine vorgeschlagene Mutation die Leistung26,27beeinflusst, sind diese Tools oft schlechte Prädiktoren für Leistung bei Cyanobakterien28,29,30.. Daher wird weiterhin die In-vivo-Charakterisierung modifizierter Teile empfohlen, um die Aktivität zu bestätigen. Um das Klonen widerspenstiger Sequenzen zu unterstützen, enthält CyanoGate einen Low Copy Cloning Acceptor Vector, der auf dem BioBrick-Vektor pSB4K512,16,31basiert. Darüber hinaus steht über die Edinburgh Genome Foundry ein “Design and Build”-Portal zur Verfügung, um beim Vector Design (dab.genomefoundry.org) zu helfen. Schließlich, und das ist am wichtigsten, CyanoGate enthält zwei Level T Akzeptor-Vektor-Designs (entspricht Level 2-Akzeptor-Vektoren)15 für die Einführung von DNA in Cyanobakterien mit Selbstmordvektoren oder breite Host-Range-Vektoren, die in der Lage sind, sich selbst zu reproduzieren in mehreren cyanobakteriellen Arten32,33,34.
Hier konzentrieren wir uns auf die Beschreibung eines Protokolls zur Erzeugung von selbstreplizierenden Vektoren der Stufe T und der genetischen Veränderung von Synechocystis PCC 6803 und Synechococcus elongatus UTEX 2973 (Synechocystis PCC 6803 und S. elongatus UTEX 2973 im Folgenden) durch Konjugation (auch bekannt als dreieltes Paarung). Der konjugale Transfer von DNA zwischen Bakterienzellen ist ein gut beschriebenes Verfahren und wurde zuvor für die Entwicklung von cyanobakteriellen Arten verwendet, insbesondere solche, die nicht natürlich kompetent sind, wie S. elongatus UTEX 297335, 36,37,38,39,40,41. Kurz gesagt, cyanobakterielle Kulturen werden mit einem E. coli-Stamm mit dem zu übertragenden Vektor (dem “Cargo”-Vektor) und Vektoren (entweder im selben E. coli-Stamm oder in zusätzlichen Stämmen) inkubiert, um eine Konjugation zu ermöglichen (“Mobilizer” und “Helfer”-Vektoren). Für die eheliche Übertragung sind vier Schlüsselvoraussetzungen erforderlich: 1) direkter Kontakt zwischen Zellen, die an der DNA-Übertragung beteiligt sind, 2) der Ladungsvektor muss mit dem Konjugationssystem kompatibel sein (d. h. er muss einen geeigneten Ursprung der Übertragung enthalten (oriT), auch bekannt als bom (Basis der Mobilität) Site), 3) ein DNA-Nickelprotein (z. B. durch das Mob-Gen kodiert), das DNA am OriT nickt, um einsträngige Übertragung der DNA in das Cyanobacterium zu initiieren, muss vorhanden und exprimiert sein von der Ladung oder den Helfervektoren, und 4) darf die übertragene DNA nicht im Empfängercyanobacterium zerstört werden (d. h. muss resistent gegen Abbau sein, z. B. durch Einschränkung endonuklease-Aktivität)35,42. Damit der Frachtvektor erhalten bleibt, muss der Ursprung der Replikation mit dem Empfänger-Cyanobacterium kompatibel sein, um die Selbstreplikation und Proliferation in Tochterzellen nach der Teilung zu ermöglichen. Um die Bedingungen 3 und 4 zu unterstützen, stehen mehrere Helfervektoren über Addgene und andere kommerzielle Quellen zur Verfügung, die für Mob kodieren, sowie mehrere Methylasen, um vor nativen Endonukleasen im Wirtcyanobacterium43zu schützen. In diesem Protokoll wurde die Konjugation durch einen MC1061 E. coli-Stamm mit Mobilisatoren und Helfervektoren pRK24 (www.addgeneorg/51950) bzw. pRL528 (www.addgene.org/58495) erleichtert. Bei der Auswahl der Vektoren, die für die eheliche Übertragung verwendet werden sollen, ist Vorsicht geboten. Im CyanoGate-Kit kodiert beispielsweise der selbstreplizierende Frachtvektor pPMQAK1-T für ein Mob-Protein12. PSEVA421-T ist jedoch nicht44, und als solcher muss mob von einem geeigneten Hilfsvektor ausgedrückt werden. Die verwendeten Vektoren sollten auch dem Zielorganismus angemessen sein. Beispielsweise erfordert eine effiziente eheliche Übertragung in Anabaena sp. PCC 7120 einen Hilfsvektor, der den Mobilizervektor vor Derverdauung schützt (z. B. pRL623, das für die drei Methylasen AvaiM, Eco47iiM und Ecot22iM kodiert45, 46.
In diesem Protokoll beschreiben wir weiter, wie die Leistung von Teilen (d. h. Promotoren) mit einem Fluoreszenzmarker mit einem Plattenleser oder einem Durchflusszytometer charakterisiert werden kann. Durchflusszytometer sind in der Lage, die Fluoreszenz auf einer einzelzelligen Basis für eine große Population zu messen. Darüber hinaus ermöglichen Durchflusszytometer es dem Benutzer, die erfassten Daten zu “torieren” und Hintergrundgeräusche zu entfernen (z. B. von Partikeln in der Kultur oder Kontamination). Im Gegensatz dazu erfassen Plattenleser eine aggregierte Fluoreszenzmessung eines bestimmten Kulturvolumens, typischerweise in mehreren Replizikern. Zu den wichtigsten Vorteilen von Plattenlesern gegenüber Zytometern zählen die niedrigeren Kosten, die höhere Verfügbarkeit und in der Regel keine Notwendigkeit für spezialsoftware für nachgelagerte Datenanalysen. Die Hauptnachteile von Plattenlesern sind die relativ geringere Empfindlichkeit im Vergleich zu Zytometern und potenzielle Probleme mit der optischen Dichte der gemessenen Kulturen. Für vergleichende Analysen müssen Plattenleserproben für jeden Brunnen normalisiert werden (z. B. zu einer Messung der Kulturdichte, typischerweise als Absorption bei der optischen Dichte bei 750 nm [OD750]), was zu Ungenauigkeiten bei proben führen kann, die zu groß sind. dicht und/oder nicht gut gemischt (z. B. wenn sie anfällig für Aggregation oder Flockung sind).
Als Überblick zeigen wir hier detailliert die Prinzipien der Erzeugung von Level 0-Teilen, gefolgt von der hierarchischen Montage mit dem CyanoGate-Kit und dem Klonen zu einem Vektor, der für die eheliche Übertragung geeignet ist. Anschließend zeigen wir den ehelichen Transferprozess, die Auswahl von axtischen transkonjuganten Stämmen, die einen fluoreszierenden Marker exdrücken, und die anschließende Erfassung von Fluoreszenzdaten mit einem Durchflusszytometer oder einem Plattenleser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Golden Gate Montage hat mehrere Vorteile im Vergleich zu anderen Vektor-Montage-Methoden, vor allem in Bezug auf Skalierbarkeit20,21. Dennoch erfordert die Einrichtung des Golden Gate-Systems in einem Labor Zeit, um eine Vertrautheit mit den verschiedenen Teilen und Akzeptor-Vektorbibliotheken und gesamten Montageprozessen zu entwickeln. Für komplexere Baugruppen oder bei der parallelen Ausführung einer großen Anzahl komplexer Baugruppen (z. B. beim Erstellen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem PHYCONET Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) Network in Industrial Biotechnology and Bioenergy (NIBB) und dem Industrial Biotechnology Innovation Centre (IBioIC) für die finanzielle Unterstützung. GARG, AASO und AP würdigen die finanzielle Unterstützung aus dem BBSRC EASTBIO CASE PhD-Programm (Grant-Nummer BB/M010996/1), dem Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT) PhD-Programm und dem IBioIC-BBSRC Collaborative Training Partnership (CTP) PhD-Programm, in dieser reihenfolge. Wir danken Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London) und Poul Eric Jensen und Julie Annemarie Zita Zedler (Universität Kopenhagen) für Plasmidvektor- und Protokollbeiträge und Beratung.
Materials
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Thermo Fisher Scientific | R0404 | Used in 2.1.3. |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt | Sigma-Aldrich | A2383 | Used in Table 2. |
| Agar (microbiology tested) | Sigma-Aldrich | A1296-500g | Used in 8.3. |
| Agarose | Bioline | BIO-41026 | Used in 6. |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | – | Used in 4.3.1. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Used in Table 2. |
| BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | Used in Table 2. |
| BsaI (Eco31I) | Thermo Fisher Scientific | ER0291 | Used in Table 2. |
| Carbenicillin disodium | VWR International | A1491.0005 | Used in 2.1.3. |
| Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Used in 4.1.3. |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | Used in 3.6.2. |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | DNA extraction kit. Used in 5. |
| FLUOstar Omega Microplate reader | BMG Labtech | – | Used in 4.2.2. |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2. |
| Glass beads (0.5 mm diameter) | BioSpec Products | 11079105 | Used in 5.2. |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 10021083 | Used in 2.3.1, 3.6.2. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | 10356553 | Used in 2.1.3. |
| Kanamycin sulphate (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11815-024 | Used in 2.1.3. |
| Membrane filters (0.45 μm) | MF-Millipore | HAWP02500 | Used in 3.3.7 |
| Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR | Greiner Bio-One | 655096 | Used in 4.2.1. |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020S | Used in 1.1.2.2. |
| Monarch PCR DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | DNA purification kit. Used in 1.1.2.3. |
| Multitron Pro incubator with LEDs | Infors HT | – | Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4. |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21108 | Used in 7.1. |
| NanoDrop One | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used in 2.3.3. |
| One Shot TOP10 chemically competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C404010 | Used in 2.1.1. |
| Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate) | VWR International | K813 | Used in 4.3.2. |
| Q5High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491S | Used in 1.1.2.1. |
| Quick-Load 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N0468S | Used in Figure 4. |
| Screw-cap tubes (1.5 ml) | Starstedt | 72.692.210 | Used in 3.6.3 |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | VWR International | J61820.06 | Used in 2.1.3. |
| Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 612U96 | Used in 4.3.1. |
| T4 DNA ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | Used in Table 2. |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Bead mill. Used in 5.2. |
References
- Luan, G., Lu, X. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnology Advances. 36 (2), 430-442 (2018).
- Madsen, M. A., Semerdzhiev, S., Amtmann, A., Tonon, T. Engineering mannitol biosynthesis in Escherichia coli and Synechococcus sp. PCC 7002 using a green algal fusion protein. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2833-2840 (2018).
- Menin, B., et al. Non-endogenous ketocarotenoid accumulation in engineered Synechocystis sp. PCC 6803. Physiologia Plantarum. 166 (1), 403-412 (2019).
- Varman, A. M., Yu, Y., You, L., Tang, Y. J. Photoautotrophic production of D-lactic acid in an engineered cyanobacterium. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-8 (2013).
- Vavitsas, K., et al. Responses of Synechocystis sp. PCC 6803 to heterologous biosynthetic pathways. Microbial Cell Factories. 16, 140 (2017).
- Yang, G., et al. Photosynthetic production of sunscreen shinorine using an engineered cyanobacterium. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 664-671 (2018).
- Nielsen, A. Z., et al. Extending the biosynthetic repertoires of cyanobacteria and chloroplasts. Plant Journal. 87 (1), 87-102 (2016).
- Nielsen, J., Keasling, J. D. Engineering cellular metabolism. Cell. 164 (6), 1185-1197 (2016).
- Stensjö, K., Vavitsas, K., Tyystjärvi, T. Harnessing transcription for bioproduction in cyanobacteria. Physiologia Plantarum. 162 (2), 148-155 (2018).
- Santos-Merino, M., Singh, A. K., Ducat, D. C. New applications of synthetic biology tools for cyanobacterial metabolic engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-24 (2019).
- Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. Journal of Visualized Experiments. 111, e54001 (2016).
- Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
- Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile golden-gate framework towards universal DNA assembly. PLoS ONE. 13 (1), 1-18 (2018).
- Crozet, P., et al. Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo toolkit enabling synthetic biology in the microalga Chlamydomonas reinhardtii. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2074-2086 (2018).
- Engler, C., et al. A Golden Gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Pollak, B., et al. Loop assembly: a simple and open system for recursive fabrication of DNA circuits. New Phytologist. 222 (1), 628-640 (2019).
- Werner, S., Engler, C., Weber, E., Gruetzner, R., Marillonnet, S. Fast track assembly of multigene constructs using golden gate cloning and the MoClo system. Bioengineered Bugs. 3 (1), 38-43 (2012).
- Patron, N. J., et al. Standards for plant synthetic biology: a common syntax for exchange of DNA parts. New Phytologist. 208 (1), 13-19 (2015).
- Chao, R., Mishra, S., Si, T., Zhao, H. Engineering biological systems using automated biofoundries. Metabolic Engineering. 42, 98-108 (2017).
- Chambers, S., Kitney, R., Freemont, P. The Foundry: the DNA synthesis and construction Foundry at Imperial College. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 687-688 (2016).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Rare codon content affects the solubility of recombinant proteins in a codon bias-adjusted Escherichia coli strain. Microbial Cell Factories. 8, 1-9 (2009).
- Cambray, G., et al. Measurement and modeling of intrinsic transcription terminators. Nucleic Acids Research. 41 (9), 5139-5148 (2013).
- Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nature Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
- Münch, R., et al. Virtual Footprint and PRODORIC: An integrative framework for regulon prediction in prokaryotes. Bioinformatics. 21 (22), 4187-4189 (2005).
- Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nature Biotechnology. 27 (10), 946-950 (2009).
- Englund, E., Liang, F., Lindberg, P. Evaluation of promoters and ribosome binding sites for biotechnological applications in the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Scientific Reports. 6, 36640 (2016).
- Heidorn, T., et al. Synthetic biology in cyanobacteria engineering and analyzing novel functions. Methods in Enzymology. 497, 539-579 (2011).
- Thiel, K., et al. Translation efficiency of heterologous proteins is significantly affected by the genetic context of RBS sequences in engineered cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbial Cell Factories. 17, 34 (2018).
- Liu, Q., Schumacher, J., Wan, X., Lou, C., Wang, B. Orthogonality and burdens of heterologous and gate gene circuits in E. coli. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 553-564 (2018).
- Ferreira, E. A., et al. Expanding the toolbox for Synechocystis sp. PCC 6803: Validation of replicative vectors and characterization of a novel set of promoters. Synthetic Biology. (August), 1-39 (2018).
- Liang, F., Lindblad, P. Synechocystis PCC 6803 overexpressing RuBisCO grow faster with increased photosynthesis. Metabolic Engineering Communications. 4, 29-36 (2017).
- Taton, A., et al. Broad-host-range vector system for synthetic biology and biotechnology in cyanobacteria. Nucleic Acids Research. 42 (17), e136 (2014).
- Elhai, J., Wolk, C. P. Conjugal transfer of DNA to cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167 (1984), 747-754 (1988).
- Gormley, E. P., Davies, J. Transfer of plasmid RSF1010 by conjugation from Escherichia coli to Streptomyces lividans and Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 173 (21), 6705-6708 (1991).
- Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P., Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a synthetic biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2577-2593 (2010).
- Huang, H. H., Lindblad, P. Wide-dynamic-range promoters engineered for cyanobacteria. Journal of Biological Engineering. 7, 10 (2013).
- Li, S., Sun, T., Xu, C., Chen, L., Zhang, W. Development and optimization of genetic toolboxes for a fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Metabolic Engineering. 48, 163-174 (2018).
- Pansegrau, W., Balzer, D., Kruft, V., Lurz, R., Lanka, E. In vitro assembly of relaxosomes at the transfer origin of plasmid RP4. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 87 (17), 6555-6559 (1990).
- Song, K., Tan, X., Liang, Y., Lu, X. The potential of Synechococcus elongatus UTEX 2973 for sugar feedstock production. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (18), 7865-7875 (2016).
- Waters, V. L., Guiney, D. G. Processes at the nick region link conjugation, T-DNA transfer and rolling circle replication. Molecular Microbiology. 9 (6), 1123-1130 (1993).
- Elhai, J., Vepritskiy, A., Muro-Pastor, A. M., Flores, E., Wolk, C. P. Reduction of conjugal transfer efficiency by three restriction activities of Anabaena sp. strain PCC 7120. Journal of Bacteriology. 179 (6), 1998-2005 (1997).
- Silva-Rocha, R., et al. The Standard European Vector Architecture (SEVA): A coherent platform for the analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes. Nucleic Acids Research. 41 (D1), D666-D675 (2013).
- Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
- Masukawa, H., Inoue, K., Sakurai, H., Wolk, C. P., Hausinger, R. P. Site-directed mutagenesis of the Anabaena sp. strain PCC 7120 nitrogenase active site to increase photobiological hydrogen production. Applied and Environmental Microbiology. 76 (20), 6741-6750 (2010).
- Yu, J., et al. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific Reports. 5 (1), 8132 (2015).
- Ungerer, J., Wendt, K. E., Hendry, J. I., Maranas, C. D., Pakrasi, H. B. Comparative genomics reveals the molecular determinants of rapid growth of the cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 115 (50), E11761-E11770 (2018).
- Lepesteur, M., Martin, J. M., Fleury, A. A comparative study of different preservation methods for phytoplankton cell analysis by flow cytometry. Marine Ecology Progress Series. 93 (1-2), 55-63 (1993).
- Day, J. G. Cryopreservation of cyanobacteria. Cyanobacteria: An Economic perspective. , 319-327 (2014).
- Zhou, J., et al. Discovery of a super-strong promoter enables efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria. Scientific Reports. 4, 4500 (2014).
- Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
- Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66, 174-176 (2006).
- Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6, 38828 (2016).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
