Modificación genética de las cianobacterias por conjugación utilizando el kit de herramientas de clonación modular CyanoGate
Summary
Aquí, presentamos un protocolo que describe cómo i) ensamblar un vector autorreplicante usando el kit de herramientas de clonación modular CyanoGate, ii) introducir el vector en un host cianobacteriano por conjugación, y iii) caracterizar las cepas de cianobacterias transgénicas usando un lector de placas o citometría de flujo.
Abstract
Las cianobacterias son un grupo diverso de organismos fotosintéticos procariotas que pueden ser modificados genéticamente para la producción renovable de productos industriales útiles. Los recientes avances en biología sintética han llevado al desarrollo de varios kits de herramientas de clonación como CyanoGate, un sistema de clonación modular estandarizado para la construcción de vectores de plásmidos para su posterior transformación o transferencia conyugal a cianobacterias. Aquí delineamos un método detallado para ensamblar un vector autorreplicante (por ejemplo, llevar un casete de expresión de marcador fluorescente) y la transferencia conyugal del vector en las cepas cianobacterianas Synechocystis sp. PCC 6803 o Synechococcus elongatus UTEX 2973. Además, describimos cómo caracterizar el rendimiento de una pieza genética (por ejemplo, un promotor) utilizando un lector de placas o citometría de flujo.
Introduction
Las cianobacterias son bacterias autotróficas que se pueden utilizar para la biosíntesis de una amplia variedad de productos metabólicos naturales y heterológicos de alto valor1,2,3,4,5, 6. Todavía es necesario superar varios obstáculos para ampliar su viabilidad comercial, sobre todo, los rendimientos relativamente pobres en comparación con las bioplataformas heterotróficas (por ejemplo, Escherichia coli y levadura)7. La reciente expansión de las herramientas de ingeniería genética disponibles y la asunción del paradigma de la biología sintética en la investigación cianobacteriana está ayudando a superar tales desafíos y a desarrollar más cianobacterias como biofábricas eficientes8, 9,10.
Los principales enfoques para introducir el ADN en las cianobacterias son la transformación, la conjugación y la electroporación. Los vectores transferidos a las cianobacterias por transformación o electroporación son vectores “suicidas” (es decir, vectores integradores que facilitan la recombinación homóloga), mientras que los vectores autorreplicantes pueden transferirse a cianobacterias por transformación, conjugación o electroporación. Para el primero, un protocolo está disponible para las especies de modelos de ingeniería susceptibles a la transformación natural11. Más recientemente, se ha desarrollado un kit de herramientas de clonación modular (MoClo) para cianobacterias llamado CyanoGate que emplea un método de ensamblaje vectorial Golden Gate estandarizado para la ingeniería utilizando la transformación natural, electroporación o conjugación12.
Las técnicas de montaje tipo Golden Gate se han vuelto cada vez más populares en los últimos años, y los estándares de montaje y las bibliotecas de piezas están ahora disponibles para una variedad de organismos13,14,15,16 ,17. Golden Gate utiliza enzimas de restricción IIS de tipo (por ejemplo, BsaI, BpiI, BsmBI, BtgZI y AarI) y un traje de aceptadores y voladizos únicos para facilitar el montaje jerárquico direccional de múltiples secuencias en una reacción de montaje “una olla”. Las enzimas de restricción de tipo IIS reconocen una secuencia asimétrica única y cortan una distancia definida de sus sitios de reconocimiento para generar un corte escalonado y “final pegajoso” (normalmente un voladizo de 4 nucleótidos [NT]), que puede ser explotado posteriormente para impulsar el ADN ordenado reacciones de montaje15,18. Esto ha facilitado el desarrollo de grandes bibliotecas de piezas modulares de nivel 0 (por ejemplo, promotores, marcos de lectura abiertos y terminadores) definidas por una sintaxis común, como el estándar PhytoBricks19. Las piezas de nivel 0 se pueden ensamblar fácilmente en casetes de expresión de nivel 1, tras lo cual se pueden construir ensamblajes de orden superior más complejos (por ejemplo, construcciones de expresión multigénea) en un vector aceptador de elección12,15. Una ventaja clave de las técnicas de montaje tipo Golden Gate es su capacidad para la automatización en instalaciones de alto rendimiento, como las fundiciones de ADN20,21, que pueden permitir la prueba de diseños experimentales complejos que fácilmente mediante el trabajo manual.
CyanoGate se basa en el sistema establecido Plant MoClo12,15. Para incorporar una nueva pieza en CyanoGate, la secuencia de la pieza debe ser domesticada primero, es decir, los sitios de reconocimiento “ilegales” para BSaI y BpiI deben ser eliminados. En el caso de una codificación de pieza para un marco de lectura abierto (es decir, una secuencia de codificación, CDS), los sitios de reconocimiento pueden verse interrumpidos mediante la generación de mutaciones sinónimos en la secuencia (es decir, cambiar un codón a una alternativa que codifica para el mismo residuo de aminoácidos). Esto se puede lograr mediante una variedad de enfoques, que van desde la síntesis de ADN hasta estrategias basadas en la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como el ensamblaje de Gibson22. Dependiendo de la expresión que se utilice el host, se debe tener cuidado de evitar la introducción de codones raros que podrían inhibir la eficiencia de la traducción23. La eliminación de sitios de reconocimiento en secuencias de promotor y terminador suele ser un esfuerzo más arriesgado, ya que las modificaciones pueden afectar a la función y la parte podría no funcionar como se esperaba. Por ejemplo, los cambios en los sitios de unión del factor de transcripción putativa o en el sitio de unión ribosoma dentro de un promotor podrían alterar la fuerza y la capacidad de respuesta a la inducción/represión. Del mismo modo, las modificaciones a las características estructurales clave del terminador (por ejemplo, el tallo rico en GC, el bucle y la cola poli-U) pueden cambiar la eficiencia de terminación y afectar la expresión génica24,25. Aunque hay varios recursos en línea disponibles para predecir la actividad de las secuencias de promotor es y terminador, e informar si una mutación propuesta afectará el rendimiento26,27, estas herramientas son a menudo malos predictores de rendimiento en cianobacterias28,29,30.. Como tal, todavía se recomienda la caracterización in vivo de las piezas modificadas para confirmar la actividad. Para ayudar con la clonación de secuencias recalcitrantes, CyanoGate incluye un vector de aceptación de clonación de copia baja basado en el vector bioBrick pSB4K512,16,31. Además, un portal “Diseño y construcción” está disponible a través de la Fundición del Genoma de Edimburgo para ayudar con el diseño de vectores (dab.genomefoundry.org). Por último, y lo más importante, CyanoGate incluye dos diseños vectoriales de aceptación de nivel T (equivalentes a vectores de aceptación de nivel 2)15 para introducir ADN en cianobacterias utilizando vectores suicidas, o vectores de amplio alcance de host capaces de autorreplicación en varias especies cianobacterianas32,33,34.
Aquí nos centraremos en describir un protocolo para generar vectores autorreplicantes de nivel T y la modificación genética de Synechocystis PCC 6803 y Synechococcus elongatus UTEX 2973 (Synechocystis PCC 6803 y S. elongatus UTEX 2973 en adelante) por conjugación (también conocida como apareamiento triparental). La transferencia conyugal del ADN entre células bacterianas es un proceso bien descrito y se ha utilizado previamente para la ingeniería de especies cianobacterianas, en particular aquellas que no son naturalmente competentes, como S. elongatus UTEX 297335, 36,37,38,39,40,41. En resumen, los cultivos cianobacterianos se incuban con una cepa de E. coli que transporta el vector a transferir (el vector “carga”) y vectores (ya sea en la misma cepa de E. coli o en cepas adicionales) para permitir la conjugación (“movilizador” y vectores “ayudantes”). Se requieren cuatro condiciones clave para que se produzca la transferencia conyugal: 1) contacto directo entre las células implicadas en la transferencia de ADN, 2) el vector de carga debe ser compatible con el sistema de conjugación (es decir, debe contener un origen adecuado de transferencia (oriT), también conocido como un sitio bom (base de movilidad),), 3) una proteína de negación del ADN (por ejemplo, codificada por el gen de la mafia) que nicks DNA en el oriT para iniciar la transferencia de una sola cadena del ADN en la cianobacterium debe estar presente y expresado de la carga o de los vectores auxiliares, y 4) el ADN transferido no debe destruirse en el ciabacterium receptor (es decir, debe ser resistente a la degradación, por ejemplo, la actividad de endonucleasa de restricción)35,42. Para que el vector de carga persista, el origen de la replicación debe ser compatible con el cianobacterium receptor para permitir la autorreplicación y la proliferación en células hijas después de la división. Para ayudar con las condiciones 3 y 4, varios vectores auxiliares están disponibles a través de Addgene y otras fuentes comerciales que codifican para la mafia, así como varias metilosas para proteger de endonucleasas nativas en el host cianobacterium43. En este protocolo, la conjugación fue facilitada por una cepa MC1061 E. coli que transportaba movilizadores y vectores auxiliares pRK24 (www.addgeneorg/51950) y pRL528 (www.addgene.org/58495), respectivamente. Se debe tener cuidado al elegir los vectores que se utilizarán para la transferencia conyugal. Por ejemplo, en el kit CyanoGate el vector de carga autorreplicante pPMQAK1-T codifica para una proteína Mob12. Sin embargo, pSEVA421-T no44, y como tal, la mafia debe expresarse desde un vector auxiliar adecuado. Los vectores utilizados también deben ser apropiados para el organismo objetivo. Por ejemplo, la transferencia conyugal eficiente en Anabaena sp. PCC 7120 requiere un vector auxiliar que proteja el vector movilizador contra la digestión (por ejemplo, pRL623, que codifica para las tres metiluas AvaiM, Eco47iiM y Ecot22iM)45, 46.
En este protocolo se describe además cómo caracterizar el rendimiento de las piezas (es decir, promotores) con un marcador fluorescente utilizando un lector de placas o un citómetro de flujo. Los citómetros de flujo son capaces de medir la fluorescencia en una sola célula para una población grande. Además, los citometros de flujo permiten a los usuarios “gatear” los datos adquiridos y eliminar el ruido de fondo (por ejemplo, de partículas en el cultivo o la contaminación). Por el contrario, los lectores de placas adquieren una medición de fluorescencia agregada de un volumen determinado de cultivo, normalmente en varios pozos de réplica. Las principales ventajas de los lectores de placas sobre los citometros incluyen el menor costo, mayor disponibilidad y, por lo general, ningún requisito de software especializado para análisis de datos aguas abajo. Los principales inconvenientes de los lectores de placas son la sensibilidad relativamente menor en comparación con los citometros y los posibles problemas con la densidad óptica de los cultivos medidos. Para los análisis comparativos, las muestras del lector de placas deben normalizarse para cada pocal (por ejemplo, para una medición de la densidad de cultivo, que normalmente se toma como absorbancia en la densidad óptica a 750 nm [OD750]), lo que puede dar lugar a imprecisiones para las muestras que son demasiado densa y/o no bien mezclada (por ejemplo, cuando es propensa a la agregación o a la floculación).
Como resumen, aquí demostramos en detalle los principios de generación de piezas de nivel 0, seguidos por el ensamblaje jerárquico utilizando el kit CyanoGate y la clonación en un vector adecuado para la transferencia conyugal. A continuación, demostramos el proceso de transferencia conyugal, la selección de cepas transconjugantes axenicas que expresan un marcador fluorescente y la posterior adquisición de datos de fluorescencia utilizando un citómetro de flujo o un lector de placas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensamblaje de Golden Gate tiene varias ventajas en comparación con otros métodos de ensamblaje vectorial, particularmente en términos de escalabilidad20,21. Sin embargo, la configuración del sistema Golden Gate en un laboratorio requiere tiempo para desarrollar una familiaridad con las diversas partes y bibliotecas vectoriales de aceptación y procesos generales de montaje. A menudo se necesita una planificación cuidadosa para ensamblajes más complejos o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen el apoyo financiero a la Red PHYCONET Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) en Biotecnología Industrial y Bioenergía (NIBB) y al Centro de Innovación en Biotecnología Industrial (IBioIC) por su apoyo financiero. GARG, AASO y AP reconocen el apoyo financiero del programa de doctorado BBSRC EASTBIO CASE (número de subvención BB/M010996/1), el programa de doctorado del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) y el programa de doctorado de la Asociación de Formación Colaborativa IBioIC-BBSRC (CTP), Respectivamente. Agradecemos a Conrad Mullineaux (Universidad Reina María de Londres), y poul Eric Jensen y Julie Annemarie Zita Zedler (Universidad de Copenhague) por las contribuciones y consejos de vectores y protocolos de plásmidos.
Materials
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Thermo Fisher Scientific | R0404 | Used in 2.1.3. |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt | Sigma-Aldrich | A2383 | Used in Table 2. |
| Agar (microbiology tested) | Sigma-Aldrich | A1296-500g | Used in 8.3. |
| Agarose | Bioline | BIO-41026 | Used in 6. |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | – | Used in 4.3.1. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Used in Table 2. |
| BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | Used in Table 2. |
| BsaI (Eco31I) | Thermo Fisher Scientific | ER0291 | Used in Table 2. |
| Carbenicillin disodium | VWR International | A1491.0005 | Used in 2.1.3. |
| Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Used in 4.1.3. |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | Used in 3.6.2. |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | DNA extraction kit. Used in 5. |
| FLUOstar Omega Microplate reader | BMG Labtech | – | Used in 4.2.2. |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2. |
| Glass beads (0.5 mm diameter) | BioSpec Products | 11079105 | Used in 5.2. |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 10021083 | Used in 2.3.1, 3.6.2. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | 10356553 | Used in 2.1.3. |
| Kanamycin sulphate (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11815-024 | Used in 2.1.3. |
| Membrane filters (0.45 μm) | MF-Millipore | HAWP02500 | Used in 3.3.7 |
| Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR | Greiner Bio-One | 655096 | Used in 4.2.1. |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020S | Used in 1.1.2.2. |
| Monarch PCR DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | DNA purification kit. Used in 1.1.2.3. |
| Multitron Pro incubator with LEDs | Infors HT | – | Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4. |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21108 | Used in 7.1. |
| NanoDrop One | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used in 2.3.3. |
| One Shot TOP10 chemically competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C404010 | Used in 2.1.1. |
| Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate) | VWR International | K813 | Used in 4.3.2. |
| Q5High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491S | Used in 1.1.2.1. |
| Quick-Load 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N0468S | Used in Figure 4. |
| Screw-cap tubes (1.5 ml) | Starstedt | 72.692.210 | Used in 3.6.3 |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | VWR International | J61820.06 | Used in 2.1.3. |
| Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 612U96 | Used in 4.3.1. |
| T4 DNA ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | Used in Table 2. |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Bead mill. Used in 5.2. |
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