Genetische modificatie van cyanobacteriën door conjugatie met behulp van de CyanoGate modulaire kloon Toolkit
Summary
Hier presenteren we een protocol met een beschrijving van hoe ik) een zelfreplicerende vector met behulp van de cyanogate modulaire kloon Toolkit, II), introduceren de vector in een cyanobacterial gastheer door conjugatie, en III) karakteriseren transgene cyanobacteriën stammen met behulp van een plaat lezer of flow cytometrie.
Abstract
Cyanobacteria zijn een gevarieerde groep prokaryotische fotosynthetische organismen die genetisch gemodificeerd kunnen worden voor de hernieuwbare productie van nuttige industriële grondstoffen. Recente ontwikkelingen in de synthetische biologie hebben geleid tot de ontwikkeling van diverse kloon toolkits zoals cyanogate, een gestandaardiseerd modulair kloon systeem voor het bouwen van plasmide vectoren voor latere transformatie of echtelijke overdracht in cyanobacteriën. Hier schetsen we een gedetailleerde methode voor het assembleren van een zelf-replicerende vector (bijv. met een fluorescerende marker Expression cassette) en echtelijke overdracht van de vector in de cyanobacteriële stammen synechocystis SP. PCC 6803 of synechococcus elongatus utex 2973. Daarnaast beschrijven we hoe u de prestaties van een genetisch deel (bijv. een promotor) karakteriseren met behulp van een plaat lezer of Flowcytometrie.
Introduction
Cyanobacteriën zijn autotrofische bacteriën die kunnen worden gebruikt voor de biosynthese van een breed scala aan natuurlijke en heterologeuze hoge waarde metabolische producten1,2,3,4,5, 6. Er moeten nog verschillende hindernissen worden overwonnen om hun commerciële levensvatbaarheid te vergroten, met name de relatief slechte opbrengsten in vergelijking met heterotrofische bio-platformen (bijv. Escherichia coli en gist)7. De recente uitbreiding van de beschikbare genetische manipulatie tools en de opname van het synthetische biologie paradigma in cyanobacteriaal onderzoek helpt om dergelijke uitdagingen te overwinnen en cyanobacteriën verder te ontwikkelen als efficiënte biofabrieken8, 9,10.
De belangrijkste benaderingen voor de introductie van DNA in cyanobacteriën zijn transformatie, conjugatie en elektroporation. De vectoren die door transformatie of elektroporation naar cyanobacteriën worden overgebracht, zijn “zelfmoord vectoren” (d.w.z. integratieve vectoren die homologe recombinatie mogelijk maken), terwijl zelfreplicerende vectoren kunnen worden overgebracht naar cyanobacteriën door transformatie, conjugatie of elektroporation. Voor de eerste, een protocol is beschikbaar voor de technische model soorten die geschikt zijn voor natuurlijke transformatie11. Meer recentelijk is een modulaire kloon (MoClo) Toolkit voor cyanobacteriën genaamd CyanoGate ontwikkeld die een gestandaardiseerde Golden Gate vector assemblage methode gebruikt voor engineering met behulp van natuurlijke transformatie, elektroporation of conjugatie12.
Golden Gate-type assemblage technieken zijn in de afgelopen jaren steeds populairder geworden, en assemblage standaarden en deel bibliotheken zijn nu beschikbaar voor een verscheidenheid aan organismen13,14,15,16 ,17. Golden Gate gebruikt type IIS restrictie enzymen (bijv. bsai, bpii, bsmbi, btgzi en AarI) en een pak acceptoren en unieke uitsteeklengten om directionele hiërarchische assemblage van meerdere sequenties in een “One pot” assembly reactie te faciliteren. Type IIS restrictie enzymen herkennen een unieke asymmetrische sequentie en knippen een gedefinieerde afstand van hun herkennings locaties om een gespreide, “Sticky end” snede te genereren (meestal een 4 nucleotide [NT] overhang), die vervolgens kan worden benut om bestelde DNA te bestellen montage reacties15,18. Dit heeft de ontwikkeling vergemakkelijkt van grote bibliotheken van modulaire niveau 0-onderdelen (bijv. promotors, open reading frames en terminators) gedefinieerd door een gemeenschappelijke syntaxis, zoals de PhytoBricks Standard19. Niveau 0-onderdelen kunnen dan gemakkelijk worden geassembleerd in Expression cassettes van niveau 1, waarna complexere hogere bestel assemblages (bijvoorbeeld multigene Expression constructies) kunnen worden ingebouwd in een accepterende vector van keuze12,15. Een belangrijk voordeel van Golden Gate-type assemblage technieken is hun geschiktheid voor automatisering bij High-throughput faciliteiten, zoals DNA-gieterijen20,21, die kunnen leiden tot het testen van complexe experimentele ontwerpen die kan niet gemakkelijk worden bereikt door handmatige arbeid.
Cyanogate bouwt voort op de gevestigde plant moclo System12,15. Om een nieuw onderdeel in CyanoGate op te nemen, moet de deel volgorde eerst gedomesticeerd worden, d.w.z. “illegale” herkennings locaties voor BsaI en BpiI moeten worden verwijderd. In het geval van een deel codering voor een open Lees frame (d.w.z. een codeer volgorde, CD’S), kunnen herkennings plaatsen worden verstoord door het genereren van synoniemen mutaties in de sequentie (d.w.z. het veranderen van een codon naar een alternatief dat codeert voor hetzelfde aminozuur residu). Dit kan worden bereikt door een verscheidenheid aan benaderingen, variërend van DNA-synthese tot polymerase chain reaction (PCR) amplificatie strategieën zoals Gibson assembly22. Afhankelijk van de uitdrukkings gastheer die wordt gebruikt, moet worden gezorgd om de introductie van zeldzame Codons te voorkomen die de efficiëntie van translatie23kunnen remmen. Het verwijderen van herkennings locaties in promoter en Terminator-reeksen is meestal een risicovollere inspanning, omdat wijzigingen de functie kunnen beïnvloeden en het onderdeel mogelijk niet zoals verwacht presteert. Bijvoorbeeld, veranderingen in de putatieve transcriptiefactor binding sites of de ribosoom binding site binnen een organisator kunnen de kracht en het reactievermogen op inductie/onderdrukking veranderen. Evenzo kunnen wijzigingen in belangrijke Terminator-structurele kenmerken (bijv. de GC Rich stam, lus en poly-U tail) de terminatie efficiëntie en het effect van genexpressie24,25veranderen. Hoewel er verschillende online bronnen beschikbaar zijn om de activiteit van de Promoter-en Terminator-sequenties te voorspellen en te informeren of een voorgestelde mutatie invloed zal hebben op de prestaties26,27, zijn deze gereedschappen vaak slechte voorspellers van prestaties in cyanobacteriën28,29,30.. Als zodanig wordt in vivo de karakterisering van gewijzigde delen nog steeds aanbevolen om de activiteit te bevestigen. Om te helpen bij het klonen van recalcitrante sequenties, bevat cyanogate een lage kopie kloon acceptor vector gebaseerd op de biobrick vector pSB4K512,16,31. Verder is er een “Design and build” portaal beschikbaar via de Edinburgh Genome Foundry om te helpen met Vector Design (dab.genomefoundry.org). Tot slot, en nog belangrijker, bevat CyanoGate twee niveau T acceptor vector ontwerpen (equivalent aan niveau 2 acceptor vectoren)15 voor de invoering van DNA in cyanobacteriën met behulp van zelfmoord vectoren, of brede host-Range vectoren die in staat zijn zelfreplicatie in verschillende cyanobacteriële soorten32,33,34.
Hier zullen we ons concentreren op het beschrijven van een protocol voor het genereren van niveau T zichzelf replicerende vectoren en de genetische modificatie van synechocystis pcc 6803 en Synechococcus elongatus Utex 2973 (synechocystis PCC 6803 en S. elongatus Utex 2973 hierna) door conjugatie (ook bekend als Tri-Parental paring). Conjugal overdracht van DNA tussen bacteriële cellen is een goed beschreven proces en is eerder gebruikt voor technische cyanobacteriële soorten, in het bijzonder die welke niet van nature competent zijn, zoals S. elongatus utex 297335, 36,37,38,39,40,41. In het kort worden cyanobacteriële culturen geïnnobeerd met een E. coli stam die de vector draagt die moet worden overgebracht (de “lading” vector) en vectoren (hetzij in dezelfde E. coli stam of in extra stammen) om conjugatie mogelijk te maken (“mobilizer” en “helper” vectoren). Er zijn vier belangrijke voorwaarden vereist voor de overdracht van conjugaat: 1) direct contact tussen cellen die betrokken zijn bij DNA-overdracht, 2) de lading vector moet verenigbaar zijn met het conjugatiesysteem (d.w.z.moet een geschikte herkomst van de overbrenging bevatten; ook bekend als een bom (basis van mobiliteit) site), 3) een DNA-nikkel-eiwit (bijv. gecodeerd door het Mob -gen) dat het DNA van de orit om één streng overdracht van het DNA in het cyanobacterium te initiëren moet aanwezig zijn en uitgedrukt van de lading of de hulp vectoren, en 4) het overgedragen DNA mag niet worden vernietigd in de ontvangende cyanobacterium (d.w.z. moet resistent zijn tegen afbraak door bijvoorbeeld een restrictie-activiteit van de endonuclease)35,42. Om de lading vector te behouden, moet de oorsprong van de replicatie verenigbaar zijn met de ontvanger cyanobacterium om zelfreplicatie en proliferatie in dochtercellen na de splitsing mogelijk te maken. Om te helpen met de voorwaarden 3 en 4, zijn verschillende hulp vectoren beschikbaar via addgene en andere commerciële bronnen die coderen voor Mob en verschillende methylases om te beschermen tegen inheemse enzym in de gastheer cyanobacterium43. In dit protocol werd conjugatie vergemakkelijkt door een MC1061 E. coli stam met mobilizer en helper vectoren pRK24 (www. addgeneorg/51950) en pRL528 (www.addgene.org/58495), respectievelijk. Zorg moet worden genomen bij het kiezen van de vectoren te gebruiken voor echtelijke overdracht. Bijvoorbeeld, in de CyanoGate Kit de zelf-replicerende Cargo vector pPMQAK1-T codeert voor een Mob proteïne12. Echter, pSEVA421-T niet44, en als zodanig, Mob moet worden uitgedrukt uit een geschikte helper vector. De gebruikte vectoren moeten ook geschikt zijn voor het doelorganisme. Efficiënte echtelijke overdracht in Anabaena SP. PCC 7120 vereist bijvoorbeeld een hulp vector die de mobilizer vector beschermt tegen de spijsvertering (bijv. pRL623, die codeert voor de drie methylases avaim, Eco47iiM en Ecot22iM)45, 46.
In dit protocol beschrijven we verder hoe de prestaties van onderdelen (d.w.z. promotors) karakteriseren met een fluorescerende marker met behulp van een plaat lezer of een flow-cytometer. Flow-Cytometers kunnen fluorescentie op één celbasis meten voor een grote populatie. Bovendien stellen Flow Cytometers gebruikers in staat om de verkregen gegevens te “hek” en achtergrondruis te verwijderen (bijvoorbeeld van deeltjes in de cultuur of verontreiniging). Plaat lezers krijgen daarentegen een geaggregeerde fluorescentie meting van een bepaald volume cultuur, meestal in verschillende replicaatputten. De belangrijkste voordelen van plaat lezers boven Cytometers zijn de lagere kosten, hogere beschikbaarheid en meestal geen vereiste voor specialistische software voor downstream data-analyses. De belangrijkste nadelen van plaat lezers zijn de relatief lagere gevoeligheid in vergelijking met Cytometers en mogelijke problemen met de optische dichtheid van gemeten culturen. Voor vergelijkende analyses moeten plaat lezers monsters voor elke put worden genormaliseerd (bijvoorbeeld voor een meting van de cultuur dichtheid, gewoonlijk genomen als de extinctie bij de optische dichtheid bij 750 nm [OD750]), wat kan leiden tot onnauwkeurigheden voor monsters die te dicht en/of niet goed gemengd (bijv. Wanneer het gevoelig is voor aggregatie of flocculatie).
Als een overzicht tonen we hier in detail de principes van het genereren van niveau 0-onderdelen, gevolgd door hiërarchische assemblage met behulp van de cyanogate-Kit en klonen in een vector die geschikt is voor echtelijke overdracht. Vervolgens demonstreren we het echtelijke overdrachtsproces, selectie van Axenische-transconjugerende stammen die een fluorescerende marker uitdrukken, en daaropvolgende overname van fluorescentie gegevens met behulp van een flow-cytometer of een plaat lezer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Golden Gate Assembly heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere vector assemblage methoden, met name in termen van schaalbaarheid20,21. Niettemin, het opzetten van de Golden Gate systeem in een Lab vergt tijd om een vertrouwdheid met de verschillende onderdelen en acceptor vector bibliotheken en algemene assemblageprocessen te ontwikkelen. Een zorgvuldige planning is vaak nodig voor complexere assemblages of bij het parallel uitvoeren van een groot aan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn dankbaar voor de FYCONET biotechnologie en biologische wetenschappen Research Council (BBSRC) netwerk in de industriële biotechnologie en bio-energie (NIBB) en de industriële biotechnologie Innovation Centre (IBioIC) voor financiële ondersteuning. GARG, AASO en AP erkennen financieringssteun van het BBSRC EASTBIO CASE PhD programma (grantnummer BB/M010996/1), het Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) PhD programma, en het IBioIC-BBSRC collaborative training Partnership (CTP) PhD programma, Respectievelijk. We danken Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London), en Poul Eric Jensen en Julie Anne Marie Zita Zedler (Universiteit van Kopenhagen) voor plasmide vector-en Protocol bijdragen en advies.
Materials
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Thermo Fisher Scientific | R0404 | Used in 2.1.3. |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt | Sigma-Aldrich | A2383 | Used in Table 2. |
| Agar (microbiology tested) | Sigma-Aldrich | A1296-500g | Used in 8.3. |
| Agarose | Bioline | BIO-41026 | Used in 6. |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | – | Used in 4.3.1. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Used in Table 2. |
| BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | Used in Table 2. |
| BsaI (Eco31I) | Thermo Fisher Scientific | ER0291 | Used in Table 2. |
| Carbenicillin disodium | VWR International | A1491.0005 | Used in 2.1.3. |
| Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Used in 4.1.3. |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | Used in 3.6.2. |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | DNA extraction kit. Used in 5. |
| FLUOstar Omega Microplate reader | BMG Labtech | – | Used in 4.2.2. |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2. |
| Glass beads (0.5 mm diameter) | BioSpec Products | 11079105 | Used in 5.2. |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 10021083 | Used in 2.3.1, 3.6.2. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | 10356553 | Used in 2.1.3. |
| Kanamycin sulphate (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11815-024 | Used in 2.1.3. |
| Membrane filters (0.45 μm) | MF-Millipore | HAWP02500 | Used in 3.3.7 |
| Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR | Greiner Bio-One | 655096 | Used in 4.2.1. |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020S | Used in 1.1.2.2. |
| Monarch PCR DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | DNA purification kit. Used in 1.1.2.3. |
| Multitron Pro incubator with LEDs | Infors HT | – | Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4. |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21108 | Used in 7.1. |
| NanoDrop One | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used in 2.3.3. |
| One Shot TOP10 chemically competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C404010 | Used in 2.1.1. |
| Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate) | VWR International | K813 | Used in 4.3.2. |
| Q5High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491S | Used in 1.1.2.1. |
| Quick-Load 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N0468S | Used in Figure 4. |
| Screw-cap tubes (1.5 ml) | Starstedt | 72.692.210 | Used in 3.6.3 |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | VWR International | J61820.06 | Used in 2.1.3. |
| Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 612U96 | Used in 4.3.1. |
| T4 DNA ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | Used in Table 2. |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Bead mill. Used in 5.2. |
References
- Luan, G., Lu, X. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnology Advances. 36 (2), 430-442 (2018).
- Madsen, M. A., Semerdzhiev, S., Amtmann, A., Tonon, T. Engineering mannitol biosynthesis in Escherichia coli and Synechococcus sp. PCC 7002 using a green algal fusion protein. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2833-2840 (2018).
- Menin, B., et al. Non-endogenous ketocarotenoid accumulation in engineered Synechocystis sp. PCC 6803. Physiologia Plantarum. 166 (1), 403-412 (2019).
- Varman, A. M., Yu, Y., You, L., Tang, Y. J. Photoautotrophic production of D-lactic acid in an engineered cyanobacterium. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-8 (2013).
- Vavitsas, K., et al. Responses of Synechocystis sp. PCC 6803 to heterologous biosynthetic pathways. Microbial Cell Factories. 16, 140 (2017).
- Yang, G., et al. Photosynthetic production of sunscreen shinorine using an engineered cyanobacterium. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 664-671 (2018).
- Nielsen, A. Z., et al. Extending the biosynthetic repertoires of cyanobacteria and chloroplasts. Plant Journal. 87 (1), 87-102 (2016).
- Nielsen, J., Keasling, J. D. Engineering cellular metabolism. Cell. 164 (6), 1185-1197 (2016).
- Stensjö, K., Vavitsas, K., Tyystjärvi, T. Harnessing transcription for bioproduction in cyanobacteria. Physiologia Plantarum. 162 (2), 148-155 (2018).
- Santos-Merino, M., Singh, A. K., Ducat, D. C. New applications of synthetic biology tools for cyanobacterial metabolic engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-24 (2019).
- Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. Journal of Visualized Experiments. 111, e54001 (2016).
- Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
- Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile golden-gate framework towards universal DNA assembly. PLoS ONE. 13 (1), 1-18 (2018).
- Crozet, P., et al. Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo toolkit enabling synthetic biology in the microalga Chlamydomonas reinhardtii. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2074-2086 (2018).
- Engler, C., et al. A Golden Gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Pollak, B., et al. Loop assembly: a simple and open system for recursive fabrication of DNA circuits. New Phytologist. 222 (1), 628-640 (2019).
- Werner, S., Engler, C., Weber, E., Gruetzner, R., Marillonnet, S. Fast track assembly of multigene constructs using golden gate cloning and the MoClo system. Bioengineered Bugs. 3 (1), 38-43 (2012).
- Patron, N. J., et al. Standards for plant synthetic biology: a common syntax for exchange of DNA parts. New Phytologist. 208 (1), 13-19 (2015).
- Chao, R., Mishra, S., Si, T., Zhao, H. Engineering biological systems using automated biofoundries. Metabolic Engineering. 42, 98-108 (2017).
- Chambers, S., Kitney, R., Freemont, P. The Foundry: the DNA synthesis and construction Foundry at Imperial College. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 687-688 (2016).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Rare codon content affects the solubility of recombinant proteins in a codon bias-adjusted Escherichia coli strain. Microbial Cell Factories. 8, 1-9 (2009).
- Cambray, G., et al. Measurement and modeling of intrinsic transcription terminators. Nucleic Acids Research. 41 (9), 5139-5148 (2013).
- Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nature Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
- Münch, R., et al. Virtual Footprint and PRODORIC: An integrative framework for regulon prediction in prokaryotes. Bioinformatics. 21 (22), 4187-4189 (2005).
- Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nature Biotechnology. 27 (10), 946-950 (2009).
- Englund, E., Liang, F., Lindberg, P. Evaluation of promoters and ribosome binding sites for biotechnological applications in the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Scientific Reports. 6, 36640 (2016).
- Heidorn, T., et al. Synthetic biology in cyanobacteria engineering and analyzing novel functions. Methods in Enzymology. 497, 539-579 (2011).
- Thiel, K., et al. Translation efficiency of heterologous proteins is significantly affected by the genetic context of RBS sequences in engineered cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbial Cell Factories. 17, 34 (2018).
- Liu, Q., Schumacher, J., Wan, X., Lou, C., Wang, B. Orthogonality and burdens of heterologous and gate gene circuits in E. coli. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 553-564 (2018).
- Ferreira, E. A., et al. Expanding the toolbox for Synechocystis sp. PCC 6803: Validation of replicative vectors and characterization of a novel set of promoters. Synthetic Biology. (August), 1-39 (2018).
- Liang, F., Lindblad, P. Synechocystis PCC 6803 overexpressing RuBisCO grow faster with increased photosynthesis. Metabolic Engineering Communications. 4, 29-36 (2017).
- Taton, A., et al. Broad-host-range vector system for synthetic biology and biotechnology in cyanobacteria. Nucleic Acids Research. 42 (17), e136 (2014).
- Elhai, J., Wolk, C. P. Conjugal transfer of DNA to cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167 (1984), 747-754 (1988).
- Gormley, E. P., Davies, J. Transfer of plasmid RSF1010 by conjugation from Escherichia coli to Streptomyces lividans and Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 173 (21), 6705-6708 (1991).
- Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P., Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a synthetic biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2577-2593 (2010).
- Huang, H. H., Lindblad, P. Wide-dynamic-range promoters engineered for cyanobacteria. Journal of Biological Engineering. 7, 10 (2013).
- Li, S., Sun, T., Xu, C., Chen, L., Zhang, W. Development and optimization of genetic toolboxes for a fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Metabolic Engineering. 48, 163-174 (2018).
- Pansegrau, W., Balzer, D., Kruft, V., Lurz, R., Lanka, E. In vitro assembly of relaxosomes at the transfer origin of plasmid RP4. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 87 (17), 6555-6559 (1990).
- Song, K., Tan, X., Liang, Y., Lu, X. The potential of Synechococcus elongatus UTEX 2973 for sugar feedstock production. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (18), 7865-7875 (2016).
- Waters, V. L., Guiney, D. G. Processes at the nick region link conjugation, T-DNA transfer and rolling circle replication. Molecular Microbiology. 9 (6), 1123-1130 (1993).
- Elhai, J., Vepritskiy, A., Muro-Pastor, A. M., Flores, E., Wolk, C. P. Reduction of conjugal transfer efficiency by three restriction activities of Anabaena sp. strain PCC 7120. Journal of Bacteriology. 179 (6), 1998-2005 (1997).
- Silva-Rocha, R., et al. The Standard European Vector Architecture (SEVA): A coherent platform for the analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes. Nucleic Acids Research. 41 (D1), D666-D675 (2013).
- Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
- Masukawa, H., Inoue, K., Sakurai, H., Wolk, C. P., Hausinger, R. P. Site-directed mutagenesis of the Anabaena sp. strain PCC 7120 nitrogenase active site to increase photobiological hydrogen production. Applied and Environmental Microbiology. 76 (20), 6741-6750 (2010).
- Yu, J., et al. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific Reports. 5 (1), 8132 (2015).
- Ungerer, J., Wendt, K. E., Hendry, J. I., Maranas, C. D., Pakrasi, H. B. Comparative genomics reveals the molecular determinants of rapid growth of the cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 115 (50), E11761-E11770 (2018).
- Lepesteur, M., Martin, J. M., Fleury, A. A comparative study of different preservation methods for phytoplankton cell analysis by flow cytometry. Marine Ecology Progress Series. 93 (1-2), 55-63 (1993).
- Day, J. G. Cryopreservation of cyanobacteria. Cyanobacteria: An Economic perspective. , 319-327 (2014).
- Zhou, J., et al. Discovery of a super-strong promoter enables efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria. Scientific Reports. 4, 4500 (2014).
- Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
- Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66, 174-176 (2006).
- Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6, 38828 (2016).
- Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
