साइनोगेट मॉड्यूलर क्लोनिंग टूलकिट का उपयोग करके साइनोबैक्टीरिया का आनुवंशिक संशोधन
Summary
यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने का वर्णन कैसे i) एक स्वयं प्रतिकृति वेक्टर को इकट्ठा CyanoGate मॉड्यूलर क्लोनिंग टूलकिट का उपयोग कर, ii) संयोजन द्वारा एक cyanobactrial मेजबान में वेक्टर परिचय, और iii) ट्रांसजेनिक cyanobacteria उपभेदों का उपयोग कर एक विशेषता प्लेट रीडर या प्रवाह साइटोमेट्री।
Abstract
सायनोबैक्टीरिया प्रोकैरियोटिक प्रकाश संश् लेषी जीवों का एक विविध समूह है जिसे उपयोगी औद्योगिक वस्तुओं के नवीकरणीय उत्पादन के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है। सिंथेटिक जीव विज्ञान में हाल ही में प्रगति ऐसे CyanoGate, बाद में परिवर्तन या सायनोबैक्टीरिया में भ्रमपूर्ण हस्तांतरण के लिए प्लाज्मिड वेक्टर के निर्माण के लिए एक मानकीकृत मॉड्यूलर क्लोनिंग प्रणाली के रूप में कई क्लोनिंग toolkits के विकास के लिए नेतृत्व किया है. यहाँ हम एक आत्म प्रतिकृति वेक्टर संयोजन के लिए एक विस्तृत विधि रूपरेखा (उदाहरण के लिए, एक फ्लोरोसेंट मार्कर अभिव्यक्ति कैसेट ले जाने) और साइनोबैक्टीरियल उपभेदों में वेक्टर के संयुग्मी हस्तांतरण Synechocystis सपा पीसीसी 6803 या Synechococcus लम्बी UTEX 2973. इसके अलावा, हम एक प्लेट रीडर या प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग कर के एक आनुवंशिक भाग (उदा., एक प्रमोटर) के प्रदर्शन की विशेषता के लिए कैसे रूपरेखा.
Introduction
सायनोबैक्टीरिया ऑटोट्रॉफिक बैक्टीरिया हैं जिनका उपयोग विभिन्न प्रकार के प्राकृतिक और विषम-वैतरणी उच्च मूल्य के चयापचय उत्पादों1,2,3,4,5के जैव संश्लेषण के लिए किया जा सकता है, 6. कई बाधाओं को अभी भी अपनी वाणिज्यिक व्यवहार्यता का विस्तार करने के लिए दूर करने की जरूरत है, सबसे विशेष रूप से, विषमपोषी जैव-प्लेटफ़ॉर्म (उदाहरण के लिए, Escherichia कोलाई और खमीर)7की तुलना में अपेक्षाकृत गरीब पैदावार. उपलब्ध आनुवंशिक इंजीनियरिंग उपकरणों के हाल के विस्तार और साइनोबैक्टीरियल अनुसंधान में सिंथेटिक जीव विज्ञान प्रतिमान के तेज ऐसी चुनौतियों पर काबू पाने और आगे कुशल biofactorys8के रूप में साइनोबैक्टीरिया विकसित करने में मदद कर रहा है, 9,10.
साइनोबैक्टीरिया में डीएनए को शुरू करने के लिए मुख्य दृष्टिकोण परिवर्तन, संयोजन और इलेक्ट्रोपोरेशन हैं। परिवर्तन या इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा सायनोबैक्टीरिया को स्थानांतरित किए गए वेक्टर “आत्महत्या” सदिश हैं (यानी, एकीकृत सदिश जो समजात पुनर्संयोजन की सुविधा प्रदान करते हैं), जबकि आत्म-प्रतिकृति सदिशों को सायनोबैक्टीरिया को स्थानांतरित किया जा सकता है रूपांतरण, संयोजन या विद्युत पोट्रेशन. पूर्व के लिए, एक प्रोटोकॉल इंजीनियरिंग मॉडल प्रजातियों के लिए उपलब्ध है प्राकृतिक परिवर्तन11के लिए अनुकूल है. हाल ही में, सायनोबैक्टीरिया के लिए एक मॉड्यूलर क्लोनिंग (MoClo) टूलकिट विकसित किया गया है जिसे सायनोगेट कहा जाता है, प्राकृतिक रूपांतरण, इलेक्ट्रोपोरेशन या कंजुगेशन12का उपयोग करके इंजीनियरिंग के लिए एक मानकीकृत गोल्डन गेट वेक्टर असेंबली विधि को रोजगार देता है।
गोल्डन गेट प्रकार विधानसभा तकनीक हाल के वर्षों में तेजी से लोकप्रिय हो गए हैं, और विधानसभा मानकों और भाग पुस्तकालयोंअब 13,14,15,16 जीवों की एक किस्म के लिए उपलब्ध हैं ,17. गोल्डन गेट प्रकार आईआईएस प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करता है (उदा., BsaI, BpiI, BsmBI, Btg]I और AarI) और स्वीकारकर्ताओं और अद्वितीय overhangs के एक सूट के लिए एक “एक बर्तन” विधानसभा प्रतिक्रिया में कई दृश्यों के दिशात्मक पदानुक्रम विधानसभा की सुविधा. प्रकार IIS प्रतिबंध एंजाइमों एक अद्वितीय असममित अनुक्रम पहचान और उनकी मान्यता साइटों से एक परिभाषित दूरी में कटौती करने के लिए एक चौंका हुआ उत्पन्न करने के लिए, “स्टिकी अंत” कटौती (आमतौर पर एक 4 न्यूक्लिओटाइड [NT] overhang), जो बाद में आदेश दिया डीएनए ड्राइव करने के लिए शोषण किया जा सकता विधानसभा प्रतिक्रियाओं15,18. यह मॉड्यूलर स्तर 0 भागों के बड़े पुस्तकालयों के विकास में मदद की है (जैसे, प्रमोटरों, खुला पढ़ने फ्रेम और टर्मिनेटर) एक आम वाक्यविन्यास द्वारा परिभाषित, जैसे PhytoBricks मानक19. स्तर 0 भागों तो आसानी से स्तर 1 अभिव्यक्ति कैसेट में इकट्ठा किया जा सकता है, जिसके बाद और अधिक जटिल उच्च आदेश विधानसभाओं (उदा. multigene अभिव्यक्ति constructs) पसंद के एक acceptor वेक्टर में बनाया जा सकताहै 12,15. गोल्डन गेट प्रकार विधानसभा तकनीकों का एक प्रमुख लाभ इस तरह के डीएनए फाउंड्री20,21,जो जटिल प्रयोगात्मक डिजाइन के परीक्षण के लिए अनुमति दे सकते हैं के रूप में उच्च throughput सुविधाओंपरस्वचालन के लिए उनकी सुविधा है कि आसानी से शारीरिक श्रम द्वारा प्राप्त नहीं किया जा सकता है.
CyanoGate स्थापित संयंत्र MoClo प्रणाली12,15पर बनाता है . CyanoGate में एक नया हिस्सा शामिल करने के लिए, भाग अनुक्रम पहले पालतू होना चाहिए, यानी, BsAI और BpiI के लिए “अवैध” मान्यता साइटों को हटाया जाना चाहिए. एक खुला पढ़ने के फ्रेम के लिए एक भाग कोडिंग के मामले में (यानी, एक कोडिंग अनुक्रम, सीडीएस), मान्यता साइटों अनुक्रम में पर्याय उत्परिवर्तन पैदा करके बाधित किया जा सकता है (यानी, एक विकल्प है कि एक ही एमिनो एसिड अवशेषों के लिए encodes के लिए एक codon बदलने). यह दृष्टिकोण की एक किस्म के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, डीएनए संश्लेषण से लेकर polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) प्रवर्धन आधारित रणनीतियों जैसे गिब्सन विधानसभा22. अभिव्यक्ति मेजबान इस्तेमाल किया जा रहा है पर निर्भर करता है, देखभाल दुर्लभ codons कि अनुवाद23की दक्षता को बाधित कर सकता है की शुरूआत से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. प्रमोटर और टर्मिनेटर दृश्यों में मान्यता साइटों को हटाना आम तौर पर एक जोखिम भरा प्रयास है, के रूप में संशोधन ों समारोह को प्रभावित कर सकते हैं और हिस्सा उम्मीद के रूप में प्रदर्शन नहीं हो सकता है. उदाहरण के लिए, एक प्रमोटर के भीतर putative प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी साइटों या राइबोसोम बाइंडिंग साइट में परिवर्तन को शामिल करने के लिए शक्ति और प्रतिक्रिया को बदल सकता है / इसी तरह, प्रमुख टर्मिनेटर संरचनात्मक सुविधाओं में संशोधन (जैसे, जीसी अमीर स्टेम, पाश और पाली-यू पूंछ) समाप्ति दक्षता और प्रभाव जीन अभिव्यक्ति24,25बदल सकते हैं। हालांकि कई ऑनलाइन संसाधनों प्रमोटर और टर्मिनेटर दृश्यों की गतिविधि की भविष्यवाणी करने के लिए उपलब्ध हैं, और सूचित करें कि क्या एक प्रस्तावित उत्परिवर्तन प्रदर्शन को प्रभावित करेगा26,27, इन उपकरणों अक्सर गरीब भविष्यवक्ताओं के हैं सायनोबैक्टीरिया28,29,30 मेंप्रदर्शन . . . इस प्रकार, संशोधित भागों के विवो अभिलक्षण न होने से अभी भी गतिविधि की पुष्टि करने की सिफारिश की जाती है। पुनर्गणना अनुक्रमों की क्लोनिंग में सहायता करने के लिए, सायनोगेट में बायोब्रिक वेक्टर pSB4K512,16,31पर आधारित कम कॉपी क्लोनिंग ग्राही वेक्टर शामिल है। इसके अलावा, एक “डिजाइन और निर्माण” पोर्टल एडिनबर्ग जीनोम फाउंड्री के माध्यम से उपलब्ध है वेक्टर डिजाइन (dab.genomefoundry.org) के साथ मदद करने के लिए. अंत में, और सबसे महत्वपूर्ण बात, CyanoGate दो स्तर टी acceptor वेक्टर डिजाइन (स्तर 2 स्वीकारकर्ता सदिश ोंक के बराबर)15 आत्महत्या सदिशों का उपयोग कर cyanobacteria में डीएनए शुरू करने के लिए, या व्यापक मेजबान रेंज वेक्टर स्व प्रतिकृति में सक्षम शामिल हैं कई सायनोबैक्टीरियल प्रजातियों में32,33,34.
यहाँ हम स्तर टी स्वयं प्रतिकृति वैक्टर और Synechocystis पीसीसी 6803 और Synechococcus longatus UTEXT 2973(Synechocystis पीसीसी 6803 और एस लम्बी के आनुवंशिक संशोधन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने पर ध्यान दिया जाएगा UTEXT 2973 इसके बाद) द्वारा संयोजन (भी त्रि-माता पिता संभोग के रूप में जाना जाता है). जीवाणु कोशिकाओं के बीच डीएनए के वैंकेदार हस्तांतरण एक अच्छी तरह से वर्णित प्रक्रिया है और पहले इंजीनियरिंग साइनोबैक्टीरियल प्रजातियों के लिए इस्तेमाल किया गया है, विशेष रूप से उन है कि स्वाभाविक रूप से सक्षम नहीं हैं, जैसे एस longatus UTEXT 297335, 36,37,38,39,40,41. संक्षेप में, सायनोबैक्टीरियल संस्कृतियों को एक ई. कोलाई तनाव के साथ इनक्यूबेट किया जाता है जो वेक्टर को स्थानांतरित किया जा सकता है (“कार्गो” वेक्टर) और वेक्टर (या तो उसी ई. कोलाई तनाव में या अतिरिक्त उपभेदों में) को संयोजन सक्षम करने के लिए (“मोबिलेयर” और “सहायक” सदिश). चार प्रमुख शर्तों को होने के लिए जुगल स्थानांतरण के लिए आवश्यक हैं: 1) डीएनए हस्तांतरण में शामिल कोशिकाओं के बीच सीधा संपर्क, 2) कार्गो वेक्टर संयोजन प्रणाली के साथ संगत होना चाहिए (यानी, यह हस्तांतरण का एक उपयुक्त मूल होना चाहिए (oriT), यह भी एक बोम (मोबिलिटी के आधार) साइट के रूप में जाना जाता है, 3) एक डीएनए निकिंग प्रोटीन (जैसे, भीड़ जीन द्वारा इनकोडिंग) कि oriT पर डीएनए nicks के लिए साइन इन करने के लिए साइनोबैक्टीरियम में डीएनए के एकल फैला हस्तांतरण आरंभ करने के लिए उपस्थित होना चाहिए और व्यक्त या तो कार्गो या सहायक सदिशों से, और 4) स्थानांतरित डीएनए प्राप्तकर्ता साइनोबैक्टीरियम में नष्ट नहीं किया जाना चाहिए (यानी, द्वारा गिरावट के लिए प्रतिरोधी होना चाहिए, उदाहरण के लिए, प्रतिबंध endonuclease गतिविधि)35,42. कार्गो वेक्टर को बनाए रखने के लिए, प्रतिकृति का मूल प्राप्तकर्ता cyanobacterium के साथ संगत होना चाहिए ताकि बेटी कोशिकाओं में आत्म-प्रतिकृति और प्रसार के लिए अनुमति दी जा सके। शर्तों के साथ सहायता करने के लिए 3 और 4, कई सहायक सदिश Addgene और अन्य वाणिज्यिक स्रोतों के माध्यम से उपलब्ध हैं कि भीड़ के लिए सांकेतिक संबंध के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई methylases मेजबान cyanobacterium43में देशी endonucleases से बचाने के लिए . इस प्रोटोकॉल में, एक MC1061 ई. कोलाई तनाव द्वारा क्रमशः कार्यकर्ता और सहायक वैक्टर pRK24 (www.addgeneorg/51950) और pRL528 (www.addgene.org/58495) द्वारा संयोजन की सुविधा प्रदान की गई थी। जब कैक्टर को संयुग्मी स्थानांतरण के लिए उपयोग किया जाना है तो सावधानी बरती जानी चाहिए। उदाहरण के लिए, CyanoGate किट में स्वयं प्रतिकृति कार्गो वेक्टर pPMQAK1-टी एक भीड़ प्रोटीन12के लिए encodes . हालांकि, pSEVA421-T44नहीं करता है, और इस तरह के रूप में, भीड़ एक उपयुक्त सहायक वेक्टर से व्यक्त किया जाना चाहिए। इस्तेमाल किया वेक्टर भी लक्ष्य जीव के लिए उपयुक्त होना चाहिए. उदाहरण के लिए, Anabaena sp. PCC 7120 में कुशल वैंग्यूगल स्थानांतरण एक सहायक वेक्टर की आवश्यकता है जो पाचन के विरुद्ध कार्यकर्ता वेक्टर की रक्षा करता है (उदाहरण के लिए, pRL623, जो तीन मिथाइलेस AvaiM, Eco47iiM और Ecot22iM के लिए encodes)45, 46.
इस प्रोटोकॉल में हम आगे रूपरेखा कैसे भागों के प्रदर्शन की विशेषता के लिए (यानी, प्रमोटरों) एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ एक प्लेट रीडर या एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर. प्रवाह cytometers एक बड़ी आबादी के लिए एक एकल सेल के आधार पर फ्लोरोसेंट को मापने में सक्षम हैं. इसके अलावा, प्रवाह cytometers उपयोगकर्ताओं को “गेट” प्राप्त डेटा और पृष्ठभूमि शोर को दूर करने के लिए अनुमति देते हैं (जैसे, संस्कृति या संदूषण में कण पदार्थ से). इसके विपरीत, प्लेट पाठकों संस्कृति के एक दिए गए मात्रा का एक समग्र फ्लोरोसेंट माप प्राप्त, आम तौर पर कई दोहराने कुओं में. cytometers पर प्लेट पाठकों के प्रमुख लाभ कम लागत, उच्च उपलब्धता और आम तौर पर डाउनस्ट्रीम डेटा विश्लेषण के लिए विशेषज्ञ सॉफ्टवेयर के लिए कोई आवश्यकता शामिल हैं. प्लेट पाठकों की मुख्य कमियां cytometers और मापा संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व के साथ संभावित मुद्दों की तुलना में अपेक्षाकृत कम संवेदनशीलता हैं. तुलनात्मक विश्लेषण के लिए, प्लेट रीडर नमूने प्रत्येक अच्छी तरह से के लिए सामान्यीकृत किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, संस्कृति घनत्व की एक माप के लिए, आम तौर पर 750 एनएम [OD750] पर ऑप्टिकल घनत्व पर अवशोषण के रूप में लिया, जो नमूने के लिए inaccuracies के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि भी कर रहे हैं घने और/या अच्छी तरह से मिश्रित नहीं (उदा., जब एकत्रीकरण या flocculation के लिए प्रवण).
एक सिंहावलोकन के रूप में, यहाँ हम विस्तार से स्तर 0 भागों पैदा करने के सिद्धांतों, CyanoGate किट और एक कंज्यूगल हस्तांतरण के लिए उपयुक्त एक वेक्टर में क्लोनिंग का उपयोग कर पदानुक्रमित विधानसभा के बाद प्रदर्शित करते हैं. हम तो एक फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त कुल्हाड़ी transconzuant उपभेदों का चयन, और एक प्रवाह साइटोमीटर या एक प्लेट रीडर का उपयोग कर फ्लोरोसेंट डेटा के बाद अधिग्रहण का प्रदर्शन संघटना हस्तांतरण प्रक्रिया.
Protocol
Representative Results
Discussion
गोल्डन गेट विधानसभा के कई फायदे हैं अन्य वेक्टर विधानसभा विधियों की तुलना में, विशेष रूप से scalability के संदर्भ में20,21. फिर भी, एक प्रयोगशाला में गोल्डन गेट प्रणाली की स्थापना के लिए समय …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक वित्तीय जैव प्रौद्योगिकी और जैव ऊर्जा (एनआईबीबी) और वित्तीय सहायता के लिए औद्योगिक जैव प्रौद्योगिकी नवाचार केंद्र (IBioIC) में PHYCONET जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (BBSRC) नेटवर्क के आभारी हैं. GARG, AASO और एपी BBSRC EASTBIO केस पीएचडी कार्यक्रम से धन सहायता स्वीकार करते हैं (अनुदान संख्या BB/M010996/1), Consezo Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACYT) पीएचडी कार्यक्रम, और IBioIC-BBSRC सहयोगी प्रशिक्षण भागीदारी (CTP) पीएचडी कार्यक्रम, क्रमशः. हम कॉनराड Mullineaux (लंदन की रानी मैरी विश्वविद्यालय), और पॉल एरिक जेन्सेन और जूली Annemerie ज़ीता ज़ेडलर (कोपेनहेगन के विश्वविद्यालय) प्लाज्मिड वेक्टर और प्रोटोकॉल योगदान और सलाह के लिए धन्यवाद.
Materials
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Thermo Fisher Scientific | R0404 | Used in 2.1.3. |
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt | Sigma-Aldrich | A2383 | Used in Table 2. |
| Agar (microbiology tested) | Sigma-Aldrich | A1296-500g | Used in 8.3. |
| Agarose | Bioline | BIO-41026 | Used in 6. |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | – | Used in 4.3.1. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Used in Table 2. |
| BpiI (BbsI) | Thermo Fisher Scientific | ER1011 | Used in Table 2. |
| BsaI (Eco31I) | Thermo Fisher Scientific | ER0291 | Used in Table 2. |
| Carbenicillin disodium | VWR International | A1491.0005 | Used in 2.1.3. |
| Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Used in 4.1.3. |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | Used in 3.6.2. |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | DNA extraction kit. Used in 5. |
| FLUOstar Omega Microplate reader | BMG Labtech | – | Used in 4.2.2. |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Fisher Scientific | K0503 | Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2. |
| Glass beads (0.5 mm diameter) | BioSpec Products | 11079105 | Used in 5.2. |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 10021083 | Used in 2.3.1, 3.6.2. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | 10356553 | Used in 2.1.3. |
| Kanamycin sulphate (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11815-024 | Used in 2.1.3. |
| Membrane filters (0.45 μm) | MF-Millipore | HAWP02500 | Used in 3.3.7 |
| Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR | Greiner Bio-One | 655096 | Used in 4.2.1. |
| Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020S | Used in 1.1.2.2. |
| Monarch PCR DNA Cleanup Kit | New England Biolabs | T1030 | DNA purification kit. Used in 1.1.2.3. |
| Multitron Pro incubator with LEDs | Infors HT | – | Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4. |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21108 | Used in 7.1. |
| NanoDrop One | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used in 2.3.3. |
| One Shot TOP10 chemically competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C404010 | Used in 2.1.1. |
| Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate) | VWR International | K813 | Used in 4.3.2. |
| Q5High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0491S | Used in 1.1.2.1. |
| Quick-Load 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N0468S | Used in Figure 4. |
| Screw-cap tubes (1.5 ml) | Starstedt | 72.692.210 | Used in 3.6.3 |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | VWR International | J61820.06 | Used in 2.1.3. |
| Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 612U96 | Used in 4.3.1. |
| T4 DNA ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | Used in Table 2. |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Bead mill. Used in 5.2. |
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