使用Tg（Vtg1：mcherry）斑马鱼胚胎测试内分泌干扰化合物的雌激素效应
Summary
目前这里是使用斑马鱼胚胎Tg（vtg1：mCherry）来检测雌激素效应的详细协议。该协议涵盖鱼类的繁殖和胚胎的治疗，并强调内分泌干扰化合物（EDC）引起的荧光信号的检测、文献和评估。
Abstract
环境中有许多内分泌干扰化合物（EDC），尤其是雌激素物质。由于这些物质的化学多样性，很难发现这些物质;因此，越来越多地使用效果检测方法，如雌激素效应敏感生物监测器/生物致病生物。这些生物监测生物体包括几种鱼类模型。该协议涵盖使用斑马鱼Tg（vtg1：mCherry）转基因线作为生物监测生物体，包括鱼类的繁殖和胚胎的治疗，重点是检测、记录和评估EDC诱导的荧光信号。这项工作的目标是演示使用Tg（vtg1：mCherry）转基因线胚胎来检测雌激素效应。这项工作记录了使用转基因斑马鱼胚胎Tg（vtg1：mCherry）通过测试两种雌激素物质α-泽拉不醇来检测雌激素效应。所述协议只是设计测定的基础;测试方法可根据测试端点和样本而变化。此外，它可以与其他测定方法相结合，从而促进转基因线的未来使用。
Introduction
在我们的环境中，有大量内分泌干扰化合物（EDC）是我们环境中最危险的物质之一。这些主要是从自然资源中污染水的雌激素化合物。属于该组的物质的化学多样性使得测试其存在变得困难，因为检测这些物质需要不同的分析方法。根据它们的化学结构，很难确定一种物质是否真的能够充当雌激素。此外，这些物质永远不会以纯形式存在于环境中，因此它们的影响可能受其他化合物的影响，太1。这个问题可以通过效果检测方法解决，例如使用生物监测器/生物致病生物，显示雌激素效应2，3，4，5。3,4,52
最近，各种细胞系6和酵母为基础的测试系统22，33已经开发出来检测雌激素效应。然而，这些通常只能检测物质与雌激素受体2，3,的结合。此外，它们无法模拟生物体中复杂的生理过程，或检测生命阶段的激素敏感阶段;因此，它们往往导致错误的结果。
众所周知，某些基因对生物体中的雌激素反应敏感。通过分子生物学方法检测基因产品也可以在蛋白质或mRNA级别8，9，9但通常涉及动物牺牲。8动物保护法已经变得更加严格，对替代性测试系统的需求也日益增长，这种试验系统可以最大限度地减少实验中使用的动物的数量和痛苦，或者用另一个模型系统10取代动物模型。随着荧光蛋白的发现和生物标志物线的产生，转基因技术提供了很好的替代方案。有了这些线，雌激素敏感基因的激活可以在体内测试。
在脊椎动物中，鱼类在环境风险评估中的潜力是突出的。与哺乳动物模型相比，它们有许多优点：作为水生生物，它们能够通过整个身体吸收污染物，产生大量的后代，而且它们的一些物种的特点是生成时间短。它们的内分泌系统和生理过程与其他脊椎动物，甚至哺乳动物，包括人类12有很大的相似之处。
几种用于检测鱼类雌激素效应的基因也已知。最重要的是雌激素受体芳香酶-b，胆碱-H，和维泰洛宁（vtg）7，13。7,13最近，一些产生雌激素的生物传感器线也创造了从鱼模型在实验室使用，如从斑马鱼（达尼奥雷里奥）4，5，14，15，16，17。4,5,14,15,16,17斑马鱼在创建生物传感器线的主要优点是胚胎和幼虫的透明体，因为荧光报告器信号可以在体内轻松研究，而不会牺牲动物10。除了动物保护，它也是一个有价值的功能，因为它允许研究同一个人的反应在治疗的不同时间18。
这些实验使用维泰洛根因记者转基因斑马鱼线15。用于开发Tg（vtg1：mCherry）的转基因结构具有长（3.4 kbp）天然维泰洛根-1启动子。雌激素受体（ER）是由配体激活的增强蛋白，是类固醇/核受体超级家庭的代表。ER结合到特定的DNA序列称为雌激素反应元素（EREs），具有高亲和力和转活性基因表达对雌二醇和其他雌激素物质的反应，所以在启动子中更多的ERE导致更强的反应19。在Tg（vtg1：mCherry）的启动区域有17个ERE位点，它们有望模仿原生vtg基因15的表达。在性成熟的女性中，荧光信号有连续的表达。然而，在雄性和胚胎中，肝脏中的表达只有在雌激素治疗时才能看到（图1）。
图1：vtg1：mCherry转基因成年斑马鱼和5dpf胚胎肝脏的红色荧光信号，17-β-雌二醇（E2）诱导后。在女性和男性治疗E2（25μg/L暴露时间：48小时）肝脏强荧光是可见的，即使通过色素的皮肤。未经治疗的雄性（A）看不到荧光信号。E2 诱导（50 μg/L 暴露时间：0-120 hpf）后，还可以观察到 5 dpf 胚胎肝脏中的红色荧光信号，这在控制胚胎（B） 中不可见。虽然荧光信号持续存在于成年女性体内，但主要为男性和胚胎，适合检测雌激素效应。（BF：亮场，mCherry：红色荧光滤光片视图，单纯图像，比例杆 A：5mm，比例杆B：250μm）请单击此处查看此图的较大版本。
与内源性维泰洛源类似，mCherry 记者只在肝脏中表达。由于维泰洛根宁只在雌激素存在的情况下产生，因此控制装置中没有荧光信号。因为表达只在肝脏，评估结果要容易得多15。
该线的胚胎的敏感性和可用性已研究的各种雌激素化合物混合物，以及环境样本15，20，在大多数情况下剂量反应15,20关系被记录（图2）。然而，在剧毒，主要是肝毒性，物质（如泽拉酮），只有非常弱的荧光信号可能可见于治疗胚胎的肝脏，最大强度荧光信号可以达到一个非常小的浓度范围内，这使得很难建立剂量效应关系20。
图2：肝脏的剂量反应图（A）和荧光图像（mCherry），在5dpf vtg1：mCherry幼虫中，暴露于17-β-乙二醇二醇（EE2）。结果表示为从信号强度和受影响区域大小（+SEM，n = 60）生成的集成密度。100% 是指观测到的最大值。荧光信号强度随着浓度的逐渐增加。比例线 = 250 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
环境中存在几种雌激素物质， 如17-μ-雌二醇（环境浓度：0.1±5.1纳克/升）21，17-β-乙酰二醇（环境浓度：0.16~0.2μg/L）22，泽拉酮 （环境浓度： 0.095~0.22 μg/L）23， 双酚-A （环境浓度： 0.45~17.2毫克/升）24.当在转基因胚胎的帮助下以纯活性形式测试这些物质时，用于荧光标志检测的最低观测效果浓度（LOEC）为17-β–雌二醇的100纳克/升， 1 ng/L 代表 17-α-乙酰二醇，100 ng/L 代表泽拉酮，1 mg/L 代表双酚-A（96-120 hpf 处理），非常接近或非常接近15.的环境浓度范围。Tg（vtg1：mCherry）转基因线有助于在直接接触后检测废水样品中的雌激素。线是敏感作为常用酵母雌激素测试，生物卢米尼森酵母雌激素（BLYES）测定15。在这条线的帮助下，使用化学混合物20证实了β-环糊精对泽拉酮诱导毒性的保护作用。
在最近的一份报告中，在两种雌激素泽拉酮（ZEA）代谢物的帮助下，在体内使用转基因线，α-泽拉醇（+-ZOL和+-ZOL）25。协议基线适合研究几种化合物或环境样本对Tg（vtg1：mCherry）胚胎的雌激素效应。
Protocol
Representative Results
Discussion
在毒理学研究中，生物监测器/生物杀病剂对雌激素效应的使用一直在蔓延。体内模型发挥着突出的作用，因为与体外测试不同，它们不仅提供有关细胞或受体反应的信息，还允许对生物体内复杂过程进行调查。研究雌激素效应的几条转基因线已经产生于斑马鱼，其中一条用于这些研究。此处描述的方法说明了用于测试此线胚胎的协议，以便检测纯活性成分体内的雌激素活性。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家研究、发展和创新基金国家研究、发展和创新办公室的支持;赠款协议：NVKP_16-1-2016-0003，EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-0008项目由欧盟共同资助，以及由创新和技术部授予的Szent István大学主题卓越项目NKFIH-831-10/2019。
Materials
| 24 well tissue culture plate | Jet Biofil | TCP011024 | |
| Calcium-chloride (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| GraphPad Prism 6.01 software | GraphPad Software Inc. | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health, USA | Public access software, downloadable from: http://imagej.nih.gov/ | |
| Leica Application Suite X calibrated software | Leica Microsystems GmbH. | We used the softver described in the experiments, but any photographic software complies with the tests | |
| Leica M205 FA stereomicroscope, Leica DFC 7000T camera | Leica Microsystems GmbH. | We used the equipments described in the experiments, but any fluorescent stereomicroscope is suitable for the tests | |
| Magnesium-sulphate (MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 20342-0-27-38 | |
| mCherry filter | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-cellulose | Sigma Aldrich Ltd. | 274429 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf GmbH. | 5242956003 | |
| Pasteur pipette | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| Petri-dish | Jet Biofil | TCD000060 | |
| Potassium-chloride (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| Sodium-chloride (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| Tricane-methanesulfonate (MS-222) | Sigma Aldrich Ltd. | E10521 |
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