Hier ist ein detailliertes Protokoll zur Verwendung von Zebrafischembryonen Tg(vtg1: mCherry) zum Nachweis von östrogene Wirkungen. Das Protokoll behandelt die Vermehrung der Fische und die Behandlung von Embryonen und betont den Nachweis, die Dokumentation und die Bewertung von fluoreszierenden Signalen, die durch endokrine Störverbindungen (EDC) induziert werden.
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Methodenartikel
Verwenden von Tg(Vtg1:mcherry) Zebrafisch-Embryonen, um die östrogene Wirkung von endokrinen störenden Verbindungen zu testen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Es gibt viele endokrine störende Verbindungen (EDC) in der Umwelt, vor allem östrogene Substanzen. Der Nachweis dieser Stoffe ist aufgrund ihrer chemischen Vielfalt schwierig; daher werden immer mehr wirkungserkennende Methoden wie östrogene effektempfindliche Biomonitor-/Bioindikatororganismen eingesetzt. Diese Biomonitoring-Organismen umfassen mehrere Fischmodelle. Dieses Protokoll betrifft die Verwendung von Zebrafisch Tg(vtg1: mCherry) transgene Linie als Biomonitoring-Organismus, einschließlich der Vermehrung von Fischen und der Behandlung von Embryonen, mit schwerpunkt auf dem Nachweis, der Dokumentation und Bewertung von fluoreszierenden Signalen, die durch EDC induziert werden. Das Ziel der Arbeit ist die Demonstration der Verwendung der transgenen Linienembryonen tg(vtg1: mCherry) zum Nachweis östrogener Wirkungen. Diese Arbeit dokumentiert die Verwendung von transgenen Zebrafischembryonen Tg(vtg1: mCherry) zum Nachweis östrogener Wirkungen durch die Prüfung von zwei östrogenen Substanzen, dem E- und dem Zearalenol. Das beschriebene Protokoll ist nur eine Grundlage für die Gestaltung von Assays; die Prüfmethode kann je nach Testendpunkt und Proben variiert werden. Darüber hinaus kann es mit anderen Assay-Methoden kombiniert werden, wodurch die zukünftige Verwendung der transgenen Linie erleichtert wird.
Einleitung
Es gibt eine erhebliche Anzahl von endokrin störenden Verbindungen (EDC), die zu den gefährlichsten Stoffen in unserer Umwelt gehören. Dies sind vor allem östrogene Verbindungen, die Wasser aus natürlichen Ressourcen kontaminieren. Die chemische Vielfalt der zur Gruppe gehörenden Stoffe erschwert die Prüfung auf ihre Anwesenheit, da für ihren Nachweis unterschiedliche Analysemethoden erforderlich sind. Aufgrund ihrer chemischen Struktur ist es sehr schwierig festzustellen, ob ein Stoff tatsächlich in der Lage ist, als Östrogen zu wirken. Darüber hinaus sind diese Stoffe nie in reiner Form in der Umwelt vorhanden, so dass ihre Auswirkungen auch durch andere Verbindunge....
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Protokoll
Das Tierprotokoll wurde nach dem ungarischen Tierschutzgesetz genehmigt, und alle Studien wurden abgeschlossen, bevor die behandelten Personen die freie Fütterungsphase erreicht hätten.
1. Embryo-Ernte und -Behandlung
- Halten Sie Tg(vtg1:mCherry) Zebrafische bei 25,5 x 0,5 °C, pH = 7 x 0,2, Leitfähigkeit zwischen 525 x 50 s/m, Sauerstoffgehalt bei 80 % der Sättigung und 14 h Licht und 10 h dunkel.
- Füllen Sie die Paarungstanks mit Systemwasser und stellen Sie die Fische für die Paarung am Nachmittag vor der Ernte Eier.
- Legen Sie die männlichen und weiblichen Fische in den Tank und trennen Sie sie mit Hil....
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Ergebnisse
In dem in diesem Manuskript vorgestellten Experiment wurden die Wirkungen von zwei östrogenen Substanzen in fünf Konzentrationen getestet, beginnend mit der Befruchtung für 5 Tage an Tg(vtg1:mCherry) Zebrafischembryonen. Wir untersuchten, ob fluoreszierende Signale in der Leber von Fischen am Ende der Expositionszeit aufgrund der Substanzen auftraten und ob es Unterschiede in der Östrogenität der beiden Substanzen gab. Die Ergebnisse wurden anhand der fluoreszierenden Bilder und integrierten Dichtewerte ausgewer.......
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Diskussion
Die Verwendung von Biomonitoren/Bioindikatoren für östrogene Wirkungen hat sich in toxikologischen Studien ausgebreitet. In-vivo-Modelle spielen eine herausragende Rolle, denn im Gegensatz zu In-vitro-Tests liefern sie nicht nur Informationen über das Ansprechen einer Zelle oder eines Rezeptors, sondern ermöglichen auch die Untersuchung komplexer Prozesse im Organismus. Mehrere transgene Linien zur Untersuchung östrogener Wirkungen wurden aus Zebrafischen hergestellt, von denen eine Tg(vtg1:mCherry) für diese St.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom National Ess-, Entwicklungs- und Innovationsamt (NKFIH) des Nationalen Fonds für Forschung, Entwicklung und Innovation (NKFIA) unterstützt. Zuschussvereinbarung: NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 Projekt, das von der Europäischen Union kofinanziert wird, und das thematische Exzellenzprogramm NKFIH-831-10/2019 der Szent Istvén Universität, das vom Ministerium für Innovation und Technologie ausgezeichnet wurde.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 24-Well-Gewebekulturplatte | Jet Biofil | TCP011024 | |
| Calciumchlorid (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| Software für GraphPad Prism 6.01 | GraphPad Software Inc. | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health, USA | Öffentlich zugängliche Software, herunterladbar unter: http://imagej.nih.gov/ | |
| Leica Application Suite X kalibrierte Software | Leica Microsystems GmbH. | Wir haben den in den Experimenten beschriebenen Softver verwendet, aber jede fotografische Software entspricht den Tests | |
| Leica M205 FA Stereomikroskop, Leica DFC 7000T Kamera | Leica Microsystems GmbH. | Wir haben die in den Experimenten beschriebenen Geräte verwendet, aber jedes fluoreszierende Stereomikroskop ist für die Tests geeignet | |
| Magnesiumsulfat (MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 20342-0-27-38 | |
| mKirschfilter | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-Cellulose | Sigma Aldrich Ltd. | ||
| Microloader Pipettenspitze | Eppendorf GmbH. | ||
| Pasteurpipette | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| Petrischale | Jet Biofil | TCD000060 | |
| Kaliumchlorid (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| Natriumchlorid (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| Trican-Methansulfonat (MS-222) | Sigma Aldrich Ltd. | Nr. E10521 |
Referenzen
- Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity o....
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Nachdrucke und Genehmigungen
