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Engineering

온도를 이용한 미세소관 기반 3D 활성 유체의 유속 제어

Published: November 26, 2019
doi:
10.3791/60484
, , ,
1Department of Physics,Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics,Brandeis University

Summary

이 프로토콜의 목표는 온도를 사용하여 3차원 활성 유체의 유속을 제어하는 것입니다. 이 방법의 장점은 현장에서 유속을 조절할 수 있을 뿐만 아니라 주기적으로 유속을 위아래로 조정하는 것과 같은 동적 제어를 가능하게 합니다.

Abstract

우리는 온도를 사용하여 키네신 구동, 미세 소관 기반 의 3 차원 (3D) 활성 유체의 유속을 조정하는 방법을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 원하는 다른 속도에 도달하기 위해 새로운 샘플을 제조할 필요 없이 도면의 속도를 조정할 수 있습니다. 또한,이 방법은 속도의 동적 제어를 할 수 있습니다. 온도를 순환하면 유체가 주기적으로 빠르고 느리게 흐릅니다. 이 제어성은 키네신-미세소관 반응의 아레니우스 특성을 기반으로 하며, 4-8 μm/s의 제어된 평균 유속 범위를 보여줍니다. 제시된 방법은 밸브없이 채널의 유량이 국부적으로 튜닝 할 수있는 미세 유체 장치의 설계에 문을 엽니 다.

Introduction

활성 물질은 화학 에너지를 기계적 작업으로 변환하는 능력으로 인해 기존의 수동 물질과 차별화됩니다. 그러한 능력을 가진 물질은 박테리아, 곤충, 콜로이드, 곡물 및 세포골격 필라멘트1,2,3,4,5,6,7,8,9,10과같은 살아 있거나 비생물성 존재체로 구성될 수 있다. 이러한 재질 개체는 이웃과 상호 작용합니다. 더 큰 규모에서, 그들은 난류와 같은 vortices (활성 난류) 또는 물질 흐름11,12,13,14,15,16,17,18,19,20으로스스로 구성한다. 활성 물질의 자기 조직에 대한 이해는 분자 셔틀, 광학 장치 및 병렬 계산21,22,23에서다양한 응용 으로 이어졌습니다. 응용 프로그램을 다음 단계로 끌어올리려면 자체 조직 이상의 제어가 필요합니다. 예를 들어, Palacci 등은 수동으로 제어되는 청색광에 노출되었을 때만 자체 추진되는 헤마타이트 캡슐화 콜로이드를 개발하여 살아있는 결정24의출현을 이끌었다. Morin 등은 튜닝 가능한 외부 전기장을 사용하여 Quincke 콜로이드를 압연하는 제어를 확립하여 경마장과 같은 채널25에서콜로이드 무리를 일으킵니다. 이 전작들은 응용 프로그램에서 로컬 제어의 역할을 보여주고 활성 물질의 지식 기반을 발전시고 있습니다.

이 기사에서는 키네신 구동, 미세 소관 (MT) 기반 3D 활성 유체의 제어성에 중점을 둡니다. 유체는 3개의 주요 분대로 이루어져 있습니다: MTs, 키네신 분자 모터 및 고갈제. 고갈제는 나중에 모터 클러스터에 의해 브리지되는 MT를 번들로 묶는 고갈력을 유도합니다. 이 모터는 더하기 끝에 있는 MTs를 따라 걷습니다. 한 쌍의 브리지 MTsis 반평행이면 해당 모터가 반대 방향으로 걷습니다. 그러나 모터는 클러스터에 바인딩되어 떨어져 걸을 수 없으므로 MT 쌍(인터필라멘트 슬라이딩, 그림 1A)을협조적으로 미끄러뜨습니다. 이러한 슬라이딩 역학이 축적되어, MTsto의 번들이 그들의 좌굴 불안정 지점에 도달할 때까지 연장된다(확장 번들, 도 1B)26. 깨진 번들은 고갈력에 의해 어닐링되어, 이어서 다시 연장되고 역학이 반복됩니다. 반복 역학의 과정에서 번들 움직임은 근처의 액체를 교반하여 미크론 스케일 추적기로 도핑하여 시각화 할 수있는 흐름을 유도합니다(그림 1C). 산체스 외 및 헨킨 외. 추적자의 평균 속도를 특징으로, 속도는 아데노신 삼인산의 농도를 변화시킴으로써 조정되었다는 것을 발견 (ATP), 고갈제, 모터 클러스터, 및 MTs19,27. 그러나, 이러한 튜닝성은 활성 유체 합성 이전에만 존재하였다. 합성 후, 튜닝성이 손실되고, 유체는 자신의 방식으로 자체 조직. 합성 후 활성 유체 활성을 조절하기 위해, Ross.et al.은 모터 단백질의 광 활성화 이각을 이용하여 유체 활성을 광28을사용하여 온/오프로 조절할 수 있는 방법을 보고했다. 빛 제어는 유체를 국소적으로 활성화하는 측면에서 편리하지만, 이 방법은 현미경으로 광학 경로를 수정하는 것과 함께 모터 단백질의 구조를 재설계해야 합니다. 여기서, 우리는 모터 구조를 그대로 유지하면서 현미경 수정없이 유체 흐름을 국부적으로 제어하는 사용하기 쉬운 방법을 제공합니다.

우리의 국소적인 활성 유체 흐름을 조정하는 방법은 키네신-MT 반응이 온도29,30,31,32와함께 증가하는 것으로 보고되었기 때문에 아레니우스 법칙에 기초한다. 우리의 이전 연구는 활성 유체 흐름의 평균 속도의 온도 의존성이 아레니우스 방정식을 따랐다는 것을 보여주었다: v = exp (-A/RT), 여기서 A는 사전 지수 인자, R은 기체 상수, E는활성화 에너지, 및 T는 시스템온도(33)이다. 따라서, 유체 활성은 온도 환경에 민감하고, 시스템 온도는 모터 성능을 안정화하기 위해 일관되어야 하며, 결과적으로, 유체 유동속도(34)가된다. 이 문서에서는 모터의 온도 의존성을 사용하여 시스템 온도를 조정하여 활성 유체의 유속을 지속적으로 조정하는 방법을 보여 줍니다. 우리는 또한 컴퓨터 소프트웨어를 통해 온도가 제어되는 현미경 단계에 샘플을 장착한 다음 활성 유체 샘플의 준비를 시연합니다. 온도를 16°C에서 36°C로 증가시키면 평균 유속이 4~8μm/s로 빨라지며, 또한 해석성은 가역적입니다: 반복적으로 온도를 증가시키고 감소시키면 순차적으로 가속화되고 감속됩니다. 입증된 방법은 MT 글라이딩 분석법29,30,31,32와같은 주요 반응이 아레니우스 법칙을 준수하는 광범위한 시스템에 적용가능하다.

Protocol

1. T의 준비 주의: 이 단계에서 우리는 소의 뇌 조직에서 수관을 정화합니다. 소 뇌는 변이체 크로이츠펠트 야콥 질환 (vCJD)35를일으킬 수 있습니다. 따라서, 뇌 폐기물 및 관련 솔루션, 병 및 파이펫 팁은 바이오 폐기물 봉투에 수거하여 기관의 규칙에 따라 생체 유해 폐기물로 폐기되어야 합니다. 소 뇌에서 튜불린을 정화 (카스놀디 등에서 수정<sup class…

Representative Results

키네신 구동, MT 기반 활성 유체를 준비하려면 키네신과 MT가 모두 필요합니다. MT는 소 뇌로부터 정제된 표지된 tubulins(단계 1.3 및 1.4)로부터 중합되었고(단계 1.1, 도 2A),순도 향상을 위해 재활용(단계 1.2, 도 2B). 키네신 운동 단백질은 대장균(단계 2.1 및 2.2단계, 도 2B)41,…

Discussion

장소에서 활성 물질을 제어하는 것은 활성 물질의 지시 자기 조직에 문을 엽니 다4,5,24,28,54. 본 기사에서는, 시스템29,30,31의아레니우스 특성에 기초하여, 온도를 이용하여 키네신 구동, MT 기반 활성 유체를 동위?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

플라스미드 K401-BCCP-H6는 즈보니미르 도딕 박사의 선물이었습니다. 이 연구는 우스터 폴리 테크닉 대학에서 박사 쿤 타 우의 창업 기금에 의해 지원되었다. 우리는 튜불린을 정화하고 라벨링하고 활성 유체를 합성하는 프로토콜에 대한 Zvonimir Dogic 박사에게 감사드립니다. 우리는 단백질 발현 및 정제에 대한 그의 전문 지식에 대한 마크 리딜라 박사에게 감사드립니다. 윌리엄 벤자민 로저 박사님이 온도 조절 스테이지를 구축할 수 있도록 도와주신 것에 대해 감사드립니다. 당사는 생물학적 물질 시설(BMF)의 사용에 대해 Brandeis MRSEC(NSF-MRSEC-1420382)를 인정합니다. 우리는 연약한 물질에베이트 외의 수치를 적응하기위한 화학의 왕립 학회를 인정33.

Materials

(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid Sigma-Aldrich 238813 Trolox
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific AC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 HACH 2074038 Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window Edmund Optics 43-637 Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape – 1/2 IN Width X 18 YD Length – 2.6 MIL Total Thickness – 27551 R.S. HUGHES 054007-27551 Copper tape
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A8937 ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A20006 Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801024 Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals Fisher Scientific ICN802829 APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1760 Ampicillin
Antivibration Table Nikon 63-7590S
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics VWR 90000-760 Agar
Biotin Alfa Aesar A14207
Bucket-plastic white – 2 gallon Bon 84-715 Water bucket
Calcium Chloride Sigma-Aldrich 746495 CaCl2
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj Nikon MRD00045 4x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift Nikon 96372 GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5 TE Technology CH-109-1.4-1.5 Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific C0378
Cooling block N/A N/A Custom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 Bio-Rad 1610400 Triphenylmethane dye
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific D128 DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics Fisher Scientific AC165680050 DTT
DOWSIL 340 Heat Sink Compound Dow 1446622 Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE Pharmco by Greenfield Global 111000200CB05 Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E3889 EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 798681 EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone Fisher Scientific BP1421 Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fisher Scientific BP1422 Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm Polysciences 18861 Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma-Aldrich G2133
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
GpCpp Jena Bioscience NU-405L Guanosine-5′[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater Amazon B07428NBCW Copper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hellmanex III Sigma-Aldrich Z805939 Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP410 NaHEPES
High performance blender machine AIMORES AS-UP1250 Blender
His GraviTrap GE Healthcare 11003399 Gravity Column
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Sigma-Aldrich I6758 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99% Pharmco by Greenfield Global 231000099 Isopropanol
JA-10 rotor Beckman Coulter 369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma-Aldrich G1501 K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670 MgCl2•6H2O
MES sodium salt Sigma-Aldrich M5057 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPS Sigma-Aldrich M1254 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022 TE Technology MP-3022 Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC138450500 TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific E112352 Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope Nikon MEA54000
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA81 UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard Thermo Fisher Scientific LC5800 Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well Thermo Fisher Scientific NP0335BOX SDS gel
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter 365672
Parafilm PM996 Wrap , 4" Wide; 125 Ft/Roll Cole-Parmer EW-06720-40 Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single
Band , 3mm Light Guide control Pod
power supply		 Nikon PE-300-UT-L-SB-40 Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830 PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% BeanTown Chemical 129745 PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23200
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Fisher Scientific A32953
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Poly(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 81300 PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific P250-500 KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) ThermoFisher Scientific PS0300 DC power supply of the gel box
PS-12-8.4A TE Technology PS-12-8.4A DC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle Sigma-Aldrich P-0294 PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour Amazon B005JWA612 Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells – Novagen Millipore Sigma 71403 Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel Amazon B01MT6JZMR Microwave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific S271-500 NaCl
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771 SDS
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S8282 NaH2PO4
Streptavidin Protein Thermo Fisher Scientific 21122
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
TC-720 TE Technology TC-720 Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade – CAS 77-86-1 – Calbiochem Sigma-Aldrich 648310 Tris-HCL
Type 45 Ti rotor Beckman Coulter 339160
Type 70 Ti rotor Beckman Coulter 337922
Type 70.1 Ti rotor Beckman Coulter 342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-916 Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 VWR 48366-227 Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium VWR 75799-268 Glass slides
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001 Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera Nikon ZYLA5.5-USB3 Monochrome CCD camera
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Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature. J. Vis. Exp. (153), e60484, doi:10.3791/60484 (2019).
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