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Controlando as velocidades de fluxo de fluidos ativos 3D baseados em microtúbulos usando temperatura

Published: November 26, 2019
doi:
10.3791/60484
, , ,
1Department of Physics,Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics,Brandeis University

Summary

O objetivo deste protocolo é usar a temperatura para controlar as velocidades de fluxo de fluidos ativos tridimensionais. A vantagem deste método não só permite regular as velocidades de fluxo in situ, mas também permite o controle dinâmico, como ajustar periodicamente as velocidades de fluxo para cima e para baixo.

Abstract

Apresentamos um método para usar a temperatura para ajustar as velocidades de fluxo de fluidos ativos tridimensionais (3D) orientados por quineinas, à base de microtúbulos. Este método permite ajustar as velocidades in situ sem a necessidade de fabricar novas amostras para atingir diferentes velocidades desejadas. Além disso, este método permite o controle dinâmico da velocidade. Andar de bicicleta a temperatura leva os fluidos a fluir rápido e lento, periodicamente. Essa controlabilidade é baseada na característica de Arrhenius da reação kinesin-microtubule, demonstrando uma faixa de velocidade de fluxo média controlada de 4-8 μm/s. O método apresentado abrirá a porta para o projeto de dispositivos microfluídicos onde as taxas de fluxo no canal são localmente tunable sem a necessidade de uma válvula.

Introduction

A matéria ativa é diferenciada da matéria passiva convencional devido à sua capacidade de converter energia química em trabalho mecânico. Um material que possui tal capacidade pode consistir em entidades vivas ou não vivas, como bactérias, insetos, coloides, grãos e filamentos citoesqueléticos1,2,3,4,5,7,8,9,10. Essas entidades materiais interagem com seus vizinhos. Em maior escala, eles se auto-organizam em vórtices turbulentos (turbulência ativa) ou fluxos materiais11,12,13,14,15,16,18,19,20. Uma compreensão da auto-organização da matéria ativa levou a várias aplicações em ônibus moleculares, dispositivos ópticos e computação paralela21,22,23. Para trazer aplicativos para o próximo nível requer controle além da auto-organização. Por exemplo, Palacci et al. desenvolveram um coloide hematita encapsulado que se autopropelia apenas quando exposto à luz azul controlada manualmente, o que levou ao surgimento de cristais vivos24. Morin et al. estabeleceram o controle dos coloides quincke rolando usando um campo elétrico externo tunable, resultando em coloidal reunindo-se em uma pista de corrida como canal25. Esses trabalhos anteriores demonstram o papel do controle local nas aplicações e promovem a base de conhecimento da matéria ativa.

Neste artigo, nos concentramos na controlabilidade dos fluidos ativos 3D baseados em quinesina, microtubule (MT). Os fluidos consistem em três componentes principais: MTs, motores moleculares de cinese e depletantes. Os depletantes induzem uma força de esgotamento para agrupar as MTs, que mais tarde são superadas por aglomerados de motores. Estes motores andam ao longo do MTstoward a extremidade mais. Quando um par de MTsis ponte anti-paralelo, os motores correspondentes andar em direções opostas. No entanto, os motores estão ligados em um cluster e são incapazes de se afastar, então eles deslizam cooperativamente pares de MTs (deslizamento de interfilamento, Figura 1A). Estas dinâmicas deslizantes se acumulam, fazendo com que os feixes de MTsto se estendem até atingir seu ponto de instabilidade e quebra (pacotes extensile, Figura 1B)26. Os feixes quebrados são annealed pela força do esgotamento, que estende subseqüentemente outra vez, e a dinâmica repete. Durante o processo de dinâmica de repetição, os movimentos do feixe agitam o líquido próximo, induzindo fluxos que podem ser visualizados pelo doping com traçadores em escala de mícron (Figura 1C). Sanchez et al. e Henkin et al. caracterizaram as velocidades médias dos traçadores, descobrindo que as velocidades eram tunable variando as concentrações de triphosfato de adenosina (ATP), depletantes, clusters motores e MTs19,27. No entanto, essa tunabilidade existia apenas antes da síntese de fluidos ativos. Após a síntese, a tunability foi perdida, e os líquidos auto-organizados em sua própria maneira. Para controlar a atividade do fluido ativo após a síntese, Ross.et al. relatou um método usando a imersão ativada pela luz das proteínas motoras, permitindo que a atividade fluida fosse ajustada e desligasse usando a luz28. Enquanto o controle de luz é conveniente em termos de ativar localmente os fluidos, o método requer redesenhar as estruturas de proteínas motoras, juntamente com a modificação dos caminhos ópticos em um microscópio. Aqui, fornecemos um método fácil de usar para controlar localmente os fluxos de fluidos sem modificação do microscópio, mantendo a estrutura motora intacta.

Nosso método de ajuste local do fluxo de fluido ativo é baseado na lei Arrhenius porque a reação kinesin-MT tem sido relatado para aumentar com a temperatura29,30,31,32. Nossos estudos anteriores mostraram que a dependência de temperatura da velocidade média de um fluxo de fluido ativo seguiu a equação de Arrhenius: v = A exp (-Ea/RT), onde A é um fator pré-exponencial, R é a constante de gás, Ea é a energia de ativação, e T é a temperatura do sistema33. Portanto, a atividade fluida é sensível ao ambiente de temperatura, e a temperatura do sistema precisa ser consistente para estabilizar o desempenho do motor e, consequentemente, a velocidade de fluxo defluido34. Neste artigo, demonstramos o uso da dependência de temperatura do motor para ajustar continuamente as velocidades de fluxo de fluidos ativos, ajustando a temperatura do sistema. Também demonstramos a preparação de uma amostra de fluido ativo, seguida pela montagem da amostra em um estágio de microscópio cuja temperatura é controlada através de software de computador. Aumentar a temperatura de 16 °C para 36 °C acelera as velocidades médias de fluxo de 4 para 8 μm/s. Além disso, a tunabilidade é reversível: aumentar e diminuir repetidamente a temperatura acelera sequencialmente e desacelera o fluxo. O método demonstrado é aplicável a uma ampla gama de sistemas onde as principais reações obedecem à lei Arrhenius, como o ensaio de deslizamento mt29,30,31,32.

Protocol

1. Preparação de MTs ATENÇÃO: Nesta etapa, purificamos as tubulinas do tecido cerebral bovino. Cérebro bovino pode causar variante doença de Creutzfeldt-Jakob (vCJD)35. Portanto, os resíduos cerebrais e soluções relacionadas, garrafas e dicas de pipetas devem ser coletados em um saco de biolixo e descartados como resíduos bioperigosos de acordo com as regras da instituição. Purify tubulins do cérebro bovino (modificado de Castoldi et al.<sup class…

Representative Results

Preparar os fluidos ativos orientados por quinesinas e MT requer ciinina e MTs. As MTs foram polimerizadas de tubulins rotuladas (etapas 1.3 e 1.4) que foram purificadas dos cérebros bovinos (passo 1.1, Figura 2A),seguidos de reciclagem para aumentar a pureza (passo 1.2, Figura 2B). As proteínas motoras de cinese foram expressas e purificadas de E. coli (passos 2.1 e 2.2, Figura 2…

Discussion

Controlar a matéria ativa in situ abre a porta para a auto-organização direcionada da matéria ativa4,5,24,28,54. Neste artigo, apresentamos um protocolo para o uso da temperatura para controlar os fluidos ativos in situ baseados em quinesina e MT, com base na característica arrhenius do sistema29,30,</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Plasmid K401-BCCP-H6 foi um presente do Dr. Zvonimir Dogic. Esta pesquisa foi apoiada pelo fundo start-up do Dr. Kun-Ta Wu no Worcester Polytechnic Institute. Agradecemos ao Dr. Zvonimir Dogic pelos protocolos para purificar e rotular a tubulina e sintetizar fluidos ativos. Somos gratos ao Dr. Marc Ridilla por sua experiência em expressão e purificação de proteínas. Agradecemos ao Dr. William Benjamin Roger por nos ajudar na construção do estágio de temperatura controlada. Reconhecemos Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) para uso da Unidade de Materiais Biológicos (BMF). Reconhecemos a Royal Society of Chemistry para adaptar os números de Bate et al. em Soft Matter33.

Materials

(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid Sigma-Aldrich 238813 Trolox
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific AC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 HACH 2074038 Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window Edmund Optics 43-637 Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape – 1/2 IN Width X 18 YD Length – 2.6 MIL Total Thickness – 27551 R.S. HUGHES 054007-27551 Copper tape
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A8937 ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A20006 Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801024 Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals Fisher Scientific ICN802829 APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1760 Ampicillin
Antivibration Table Nikon 63-7590S
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics VWR 90000-760 Agar
Biotin Alfa Aesar A14207
Bucket-plastic white – 2 gallon Bon 84-715 Water bucket
Calcium Chloride Sigma-Aldrich 746495 CaCl2
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj Nikon MRD00045 4x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift Nikon 96372 GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5 TE Technology CH-109-1.4-1.5 Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific C0378
Cooling block N/A N/A Custom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 Bio-Rad 1610400 Triphenylmethane dye
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific D128 DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics Fisher Scientific AC165680050 DTT
DOWSIL 340 Heat Sink Compound Dow 1446622 Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE Pharmco by Greenfield Global 111000200CB05 Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E3889 EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 798681 EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone Fisher Scientific BP1421 Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fisher Scientific BP1422 Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm Polysciences 18861 Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma-Aldrich G2133
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
GpCpp Jena Bioscience NU-405L Guanosine-5′[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater Amazon B07428NBCW Copper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hellmanex III Sigma-Aldrich Z805939 Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP410 NaHEPES
High performance blender machine AIMORES AS-UP1250 Blender
His GraviTrap GE Healthcare 11003399 Gravity Column
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Sigma-Aldrich I6758 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99% Pharmco by Greenfield Global 231000099 Isopropanol
JA-10 rotor Beckman Coulter 369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma-Aldrich G1501 K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670 MgCl2•6H2O
MES sodium salt Sigma-Aldrich M5057 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPS Sigma-Aldrich M1254 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022 TE Technology MP-3022 Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC138450500 TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific E112352 Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope Nikon MEA54000
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA81 UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard Thermo Fisher Scientific LC5800 Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well Thermo Fisher Scientific NP0335BOX SDS gel
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter 365672
Parafilm PM996 Wrap , 4" Wide; 125 Ft/Roll Cole-Parmer EW-06720-40 Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single
Band , 3mm Light Guide control Pod
power supply		 Nikon PE-300-UT-L-SB-40 Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830 PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% BeanTown Chemical 129745 PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23200
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Fisher Scientific A32953
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Poly(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 81300 PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific P250-500 KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) ThermoFisher Scientific PS0300 DC power supply of the gel box
PS-12-8.4A TE Technology PS-12-8.4A DC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle Sigma-Aldrich P-0294 PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour Amazon B005JWA612 Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells – Novagen Millipore Sigma 71403 Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel Amazon B01MT6JZMR Microwave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific S271-500 NaCl
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771 SDS
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S8282 NaH2PO4
Streptavidin Protein Thermo Fisher Scientific 21122
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
TC-720 TE Technology TC-720 Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade – CAS 77-86-1 – Calbiochem Sigma-Aldrich 648310 Tris-HCL
Type 45 Ti rotor Beckman Coulter 339160
Type 70 Ti rotor Beckman Coulter 337922
Type 70.1 Ti rotor Beckman Coulter 342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-916 Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 VWR 48366-227 Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium VWR 75799-268 Glass slides
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001 Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera Nikon ZYLA5.5-USB3 Monochrome CCD camera
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References

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Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature. J. Vis. Exp. (153), e60484, doi:10.3791/60484 (2019).
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