التحليل الزماني المكاني للتدفق الميداني للاوعيه الدموية
Summary
لقياس تدفق الاوعيه الدقيقة من السرعة العالية تسلسل صوره تدفق الشعرية ، قمنا بتطوير الموظفين (التحليل الزماني المكاني للتدفق الميداني) البرمجيات. ويقوم الموظفون ، عبر حقل الصورة الكاملة وبمرور الوقت ، بتقييم سرعات التدفق ويولد سلسله من الخرائط المكانية المرمزة بألوان لأغراض التصور والمخرجات الجدولية للتحليلات الكمية.
Abstract
التغييرات في سرعه تدفق الدم والتوزيع هي حيوية في الحفاظ علي الانسجه والجسم الانصهار استجابه لاحتياجات الخلوية المختلفة. وعلاوة علي ذلك ، يمكن ان يكون ظهور العيوب في دوران الاوعيه الدقيقة مؤشرا أساسيا في تطور الامراض المتعددة. وقد جعلت التطورات في التصوير البصري انترافيتال المجهري (IVM) نهجا عمليا ، مما يسمح بالتصوير علي المستوي الخلوي ودون الخلوي في الكائنات الحية بسرعة عاليه مع مرور الوقت. ومع ذلك ، وعلي الرغم من اهميه الحفاظ علي الانسجه الكافية ، ونادرا ما يتم توثيق التغير المكاني والزماني في تدفق الشعرية. في النهج القياسي ، يتم اختيار عدد صغير من الشرائح الشعرية للتصوير علي مدي فتره زمنيه محدوده. لقياس التدفق الشعري بشكل شامل بطريقه غير متحيزة قمنا بتطوير التحليل الزماني المكاني للتدفق الميداني (الموظفين) ، وهو ماكرو لبرنامج تحليل الصور المفتوح المصدر من فيجي. باستخدام تسلسلات الصور عاليه السرعة من الحقول الكاملة لتدفق الدم داخل الشعيرات الدموية ، والموظفين تنتج الصور التي تمثل الحركة علي مر الزمن تسمي kymographs البيانية لكل فاصل زمني لكل قطعه الاوعيه الدموية. ويحسب الموظفون السرعات من المسافة التي تتحرك بها خلايا الدم الحمراء بمرور الوقت ، وينتجون بيانات التسارع كسلسلة من الخرائط المكانية المرمزة بألوان لأغراض التصور والمخرجات الجدولية للتحليلات الكمية. في كبد الفار العادي ، يحلل الموظفون الاختلافات العميقة الكمية في سرعه التدفق بين مناطق بيريسينترال والمداخل داخل اللوصات. حتى أكثر غير متوقعه هي الاختلافات في سرعه التدفق ينظر بين جيوب التي هي جنبا إلى جنب والتقلبات التي شوهدت داخل أجزاء الاوعيه الدموية الفردية علي مدي ثوان. الموظفين هو أداه جديده قويه قادره علي توفير رؤى الرواية من خلال تمكين قياس ديناميات المكانية المعقدة للتدفق الشعرية.
Introduction
يلعب الاوعيه المجهرية دورا حاسما في علم وظائف الجسم ، وضمان الانصهار الفعال للانسجه في ظل الظروف المتغيرة. يرتبط ضعف الاوعيه الدموية المجهرية مع العديد من الظروف بما في ذلك الامراض القلبية الوعائية علي المدى الطويل والوفاات ، وتطوير الخرف، والمرض من الكبد والكلي علي حدسواء ،التالي هو عامل رئيسي للاهتمام في مجموعه واسعه منالتحقيقات الطبيةالحيوية في حين تم استخدام تقنيات متعددة لتقييم perfusion الانسجه ، فقط انترافيتال المجهر تمكن جمع البيانات في الدقة الزمانيه والمكانية اللازمة لتوصيف تدفق الدم علي مستوي الشعيرات الدموية الفردية.
يمكن تصور تدفق الاوعيه الدقيقة في المجهر الفلوري اما عن طريق حركه الفلورسنت المجهرية أو عن طريق حركه خلايا الدم الحمراء علي خلفيه من الغشاء-التي تهدد علامات الفلورسنت (علي سبيل المثال ، فلوريسسينتلي المسمية ديكسان أو الزلال)6،7. يمكن ان يكون تدفق الاوعيه الدموية المجهرية في طبقات الخلايا السطحية باستخدام المجهر المجهري ، أو في العمق باستخدام اما المجهر البؤري أو متعدد الفوتونات. ومع ذلك ، فان معدلات تدفق الشعرية هي بحيث لا يمكن عموما القبض علي مرور خلايا الدم الحمراء بسرعات اقل من 60 الإطارات/ثانيه. وبما ان معظم المجهر الضوئي بالليزر والمجاهر متعددة الفوتونات تتطلب 1 – 5 ثانيه لمسح حقل الصورة الكاملة ، فان هذه السرعة يمكن ان تنجز بشكل عام فقط عن طريق الحد من مجال الرؤية ، وأحيانا إلى خط مسح واحد8. عمليه الحد من القياسات لشرائح شعريه مختاره (1) لديها القدرة علي إدخال التحيز الاختيار و (2) يجعل من المستحيل للتقاط التغاير المكاني والزماني في معدلات تدفق الدم الشعرية. وفي المقابل ، يمكن جمع الصور من الشبكات الشعرية بسرعات تتجاوز 100 fps باستخدام ويديفيلد المجاهر الرقمية مجهزه العلمية التكميلية أكسيد المعادن أشباه الموصلات (scmos) كاميرات9،10. هذه النظم غير مكلفه ، الشائعة في المختبرات الطبية الحيوية النموذجية تجعل من الممكن للصورة تدفق الاوعيه الدقيقة عبر الشبكات ثنائيه الابعاد بأكملها ، أساسا بشكل مستمر. ثم تصبح المشكلة واحده من العثور علي نهج تحليل قادره علي استخراج بيانات كميه ذات مغزى من مجموعات الصور الضخمة والمعقدة المتولدة عن المجهر الفيديو عاليه السرعة.
لتمكين تحليل بيانات تدفق الحقول الكاملة قمنا بتطوير الموظفين ، والبرمجيات الجديدة لتحليل الصور التي يمكن ان تقيس باستمرار تدفق الاوعيه الدقيقة في جميع انحاء حقول المجهر كامله من سلسله الصور التي تم جمعها بسرعة عاليه11. ويتوافق هذا النهج مع مجموعه متنوعة من النظم التجريبية المختلفة وطرائق التصوير ، وينفذ برنامج تحليل صور الموظفين كمجموعه أدوات ماكرة لتنفيذ فيجي ل ImageJ12. المبدا الأساسي المستخدم هنا لتصور تدفق الاوعيه الدموية المجهرية هو ان أولا ، يجب توفير بعض التباين لتكون قادره علي صوره خلايا الدم الحمراء داخل الشعيرات الدموية. في دراساتنا ، يتم توفير التباين من خلال مسبار الفلورسنت السائبة التي يتم استبعادها من قبل خلايا الدم الحمراء. ويمكن بعد ذلك تحديد سرعه تدفق من النزوح من خلايا الدم الحمراء التي تظهر كوصمه عار السلبية داخل فلوريسسينتلي المسمي البلازما في الصور التي تم جمعها بسرعة عاليه من الحيوانية الحية8. ثم نستخدم الموظفين لجعل قطع المسافة علي طول كل قطعه شعريه علي فترات متعددة من الوقت يسمي kymographs ، ثم الكشف عن المنحدرات الموجودة في kymographs13، ومن تلك المنحدرات حساب معدلات تدفق ميكرووعائي. ويمكن تطبيق هذا النهج علي الصور التي تم جمعها من اي سرير الشعرية التي يمكن الوصول اليها للتصوير. هنا نحن وصف تطبيق IVM والموظفين لدراسات تدفق الدم في الكبد.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك عده خطوات هامه في هذا البروتوكول. أولا ، تقليل الحركة اثناء التصوير الانترافيتال للكبد أمر ضروري لتوليد الأفلام التي يمكن استخدامها لتحليل تدفق الشعرية بواسطة الموظفين. بسبب قرب الحجاب الحاجز ، تحدث فترات قصيرة من الحركة المستحثة بالتنفس ، مع عوده الكبد المضمون إلى موضعه الاولي بعد …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت الدراسات المقدمة هنا بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (المعهد القومي للصحة U01 GM111243 و “نيدك” P30 DK079312). أجريت دراسات مجهريه انترافيتال في مركز إنديانا لمجهري البيولوجي. نشكر الدكتور مالجورزاتا كاموككا للحصول علي المساعدة التقنية بالمجهر.
Materials
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing .011x.024in |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2×2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 Ga.x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
References
- Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
- Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
- Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
- Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
- Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , (2012).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Huang, Z. -. L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156 (2011).
- Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Liu, Z. -. Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
- Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
- Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052 (2013).
- Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106 (2013).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303 (2015).
- Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), 416-425 (2016).
- Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341 (2014).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).
