Análise Temporal Espacial do Fluxo de Campo na Microvasculatura

Summary

Para quantificar o fluxo microvascular de sequências de imagem capilar de fluxo de alta velocidade, desenvolvemos o software STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). Em todo o campo de imagem completo e ao longo do tempo, a EQUIPE avalia as velocidades de fluxo e gera uma sequência de mapas espaciais codificados por cores para visualização e saída tabular para análises quantitativas.

Abstract

As alterações na velocidade e distribuição do fluxo sanguíneo são vitais para manter a perfusão de tecidos e órgãos em resposta às diferentes necessidades celulares. Além disso, o aparecimento de defeitos na microcirculação pode ser um indicador primário no desenvolvimento de múltiplas patologias. Os avanços nas imagens ópticas fizeram da microscopia intravital (IVM) uma abordagem prática, permitindo imagens a nível celular e subcelular em animais vivos em alta velocidade ao longo do tempo. No entanto, apesar da importância de manter a perfusão de tecido adequada, a variabilidade espacial e temporal no fluxo capilar raramente é documentada. Na abordagem padrão, um pequeno número de segmentos capilares são escolhidos para imagens ao longo de um tempo limitado. Para quantificar de forma abrangente o fluxo capilar de uma forma imparcial, desenvolvemos a Análise Temporal Espacial do Fluxo De Campo (STAFF), uma macro para o software de análise de imagem de código aberto de FIJI. Usando sequências de imagem de alta velocidade de campos cheios de fluxo sanguíneo dentro de capilares, staff produz imagens que representam o movimento ao longo do tempo chamado kymographs para cada intervalo de tempo para cada segmento vascular. A partir dos kymographs STAFF calcula velocidades da distância que os glóbulos vermelhos se movem ao longo do tempo, e fornece os dados de velocidade como uma seqüência de mapas espaciais codificados por cores para visualização e saída tabular para análises quantitativas. Em fígados de camundongos normais, a STAFF analisa diferenças profundas quantificadas na velocidade do fluxo entre regiões pericentrais e periportal dentro dos lóbulos. Ainda mais inesperadas são as diferenças na velocidade do fluxo observadas entre os sinusoids que estão lado a lado e flutuações observadas dentro de segmentos vasculares individuais ao longo de segundos. A EQUIPE É uma nova ferramenta poderosa capaz de fornecer novos insights, permitindo a medição da complexa dinâmica espaçotemporal do fluxo capilar.

Introduction

A microvasculatura desempenha um papel crítico na fisiologia, garantindo uma perfusão eficaz de tecidos em condições de mudança. A disfunção microvascular está associada a inúmeras condições, incluindo morbidade cardiovascular e mortalidade a longo prazo, desenvolvimento de demência e doença de fígado e rim e, portanto, é um fator-chave de interesse em uma ampla gama de investigações biomédicas^1,2,3,4,5. Embora várias técnicas tenham sido usadas para avaliar a perfusão de tecidos, apenas a microscopia intravital permite a coleta de dados na resolução temporal e espacial necessária para caracterizar o fluxo sanguíneo no nível de capilares individuais.

O fluxo microvascular pode ser visualizado em microscopia de fluorescência pelo movimento de microesferas fluorescentes ou pelo movimento dos glóbulos vermelhos no contexto de marcadores fluorescentes impermeant da membrana (por exemplo, dextran fluorescente-etiquetados ou albumina)^6,7. O fluxo microvascular pode ser imageado em camadas de células superficiais usando microscopia widefield ou em profundidade usando microscopia confocal ou multifoton. No entanto, as taxas de fluxo capilar são tais que a passagem de glóbulos vermelhos geralmente não pode ser capturada a velocidades inferiores a 60 quadros/s. Uma vez que a maioria dos microscópios confocal e multifoton de varredura a laser exigem 1-5 s para digitalizar um campo de imagem completo, essa velocidade geralmente pode ser realizada apenas limitando o campo de visão, às vezes a uma única linha de digitalização⁸. O processo de limitação de medições a segmentos capilares selecionados (1) tem o potencial de introduzir viés de seleção e (2) torna impossível a captura de heterogeneidade espacial e temporal nas taxas de fluxo sanguíneo capilar. Em contraste, imagens de redes capilares podem ser coletadas em velocidades superiores a 100 fps usando microscópios digitais widefield equipados com câmeras científicas complementares de semicondutores de óxido metálico (sCMOS)^9,10. Estes sistemas baratos, comuns em laboratórios biomédicos típicos tornam possível a imagem de fluxo microvascular em redes bidimensionais inteiras, essencialmente continuamente. O problema, em seguida, torna-se um de encontrar uma abordagem de análise que é capaz de extrair dados quantitativos significativos dos conjuntos de dados de imagem maciça e complexa gerada pela microscopia de vídeo de alta velocidade.

Para permitir a análise de dados de fluxo de campo completo, desenvolvemos a STAFF, novo software de análise de imagem que pode medir continuamente o fluxo microvascular em campos de microscópio inteiros de séries de imagens coletadas em alta velocidade^11. A abordagem é compatível com uma variedade de diferentes sistemas experimentais e modalidades de imagem e o software de análise de imagem STAFF é implementado como um conjunto de ferramentas macro para a implementação de Fiji do ImageJ¹². O princípio subjacente usado aqui para visualizar o fluxo microvascular é que, em primeiro lugar, algum contraste deve ser fornecido para ser capaz de imagem dos glóbulos vermelhos dentro de capilares. Em nossos estudos, o contraste é fornecido por uma sonda fluorescente em massa que é excluída pelos glóbulos vermelhos. A velocidade do fluxo pode então ser quantificada a partir do deslocamento dos glóbulos vermelhos que aparecem como uma mancha negativa dentro do plasma fluorescente mente rotulado em imagens coletadas em alta velocidade de um animal vivo⁸. Em seguida, usamos a EQUIPE para fazer parcelas de distância ao longo de cada segmento capilar ao longo de vários intervalos de tempo chamados kymographs, em seguida, detectar as encostas presentes nos kymographs^13,e a partir dessas encostas calcular as taxas de fluxo microvascular. A abordagem pode ser aplicada a imagens coletadas de qualquer leito capilar que possa ser acessado para imagens. Aqui descrevemos a aplicação de IVM e STAFF para estudos de fluxo sanguíneo no fígado.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram aprovados e realizados de acordo com as diretrizes do Institutional Animal Care and Use Committee da Universidade de Indiana, e aderiram ao guia nrc para o cuidado e uso de animais. 1. Preparação cirúrgica para microscopia intravital Nota: Isto não é uma cirurgia de sobrevivência. Uma vez iniciada a seção 1 “Preparação cirúrgica para microscopia intravital”, os trabalhos não podem ser pausados até a…

Representative Results

A análise da equipe gera um censo completo de velocidades microvasculares em campos de microscópio inteiros ao longo de períodos de tempo que se estende de segundos a minutos. Os resultados representativos são apresentados na Figura 1, Figura 2, Figura 3e Figura 4. A Figura 1 mostra um exemplo de uma série temporal da rede microvascular no fígado de um camundongo, a g…

Discussion

Há vários passos críticos neste protocolo. Primeiro, a minimização do movimento durante a imagem intravital do fígado é essencial para gerar filmes que são utilizáveis para análise de fluxo capilar usando staff. Devido à proximidade do diafragma, ocorrem curtos períodos de movimento induzido pela respiração, com o fígado seguro retornando à sua posição inicial após cada respiração. Proteger o fígado exposto cirurgicamente contra o prato com fundo de coverslip usando gaze, em seguida, a imagem de bai…

Materials

#5 forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5 Inox Forceps
C57BL/6 mice	Jackson Labs		male 9-12 weeks old
Cannula	Instech	BTPE-10	Polyethylene Tubing .011x.024in
CMOS camera	Hamamatsu	C11440-42U30	4.0LT Scientific CMOS
Coverslip-bottomed dish	Electron Microscopy Sciences		WillCo Dish glass bottom GWST5040
Dissecting scissors	Fine Science Tools
Fiji ImageJ Image analysis software			https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip
Fluorescein dextran	Thermo Fisher, Invitrogen	D1822	Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable
Gauze sponge	Fisher	22-415-504	2×2 inch Dukal sterile gauze sponges
Heating pad	Reptitherm	RH-4	between mouse and stage
Heating pad	Sunbeam	000732-500-000U	over mouse
Inverted epifluorescence microscope	Nikon		Nikon TiE inverted microscope
Isis Rodent electric shaver	Braun Aesculap	GT420
Isofluorane	Abbott GmbH	PZN4831850
Luer stub adapter	Fisher	14-826-19E	Catheter adapter
Micro scissors	Castro Viejo
Microscope objective	Nikon		Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion
Needle	Fisher		30 Ga.x1/2"
Needle holder	Olsen-Hegar
Objective heater	BioScience Tools	MTC-HLS-025	Temperature controller with objective heater
Rectal thermometer	Braintree Scientific, INC	TH-5A	Mouse Body Temperature monitoring
STAFF macros			https://github.com/icbm-iupui/STAFF
Suture string	Harvard Bioscience	723288	silk black suture, 6-0, spool