Пространственный временный анализ полевой поток в микроваскулярной
Summary
Для количественной оценки микрососудистого потока из высокоскоростных капиллярных последовательностей капиллярного потока мы разработали программное обеспечение STAFF (пространственный временный анализ потока Fieldwise Flow). Через полное поле изображения и с течением времени STAFF оценивает скорость потока и генерирует последовательность цветных пространственных карт для визуализации и таблического вывода для количественного анализа.
Abstract
Изменения в скорости кровотока и распределении имеют жизненно важное значение для поддержания перфузии тканей и органов в ответ на различные клеточные потребности. Кроме того, появление дефектов в микроциркуляции может быть основным показателем в развитии множественных патологий. Достижения в области оптической визуализации сделали интравитальной микроскопии (IVM) практический подход, позволяющий изображения на клеточном и субклеточном уровне у живых животных на высокой скорости с течением времени. Тем не менее, несмотря на важность поддержания адекватного перфузии тканей, пространственная и височная изменчивость капиллярного потока редко документируется. В стандартном подходе небольшое количество сегментов капилляров выбираются для визуализации в течение ограниченного времени. Для всесторонней количественной оценки капиллярного потока беспристрастным образом мы разработали пространственный временный анализ потока Fieldwise (STAFF), макрос для программного обеспечения для анализа изображений с открытым исходным кодом FIJI. Используя высокоскоростные последовательности изображений полных полей кровотока в капиллярах, STAFF производит изображения, которые представляют движение с течением времени, называемые kymographs для каждого интервала времени для каждого сосудистого сегмента. Из kymographs STAFF вычисляет скорости с расстояния, которое красные кровяные клетки движутся с течением времени, и выводит данные о скорости как последовательность цветных пространственных карт для визуализации и табличных выходных данных для количественного анализа. В нормальных печени мыши, STAFF анализирует количественные глубокие различия в скорости потока между перицентральных и перипортаранных регионов в пределах lobules. Еще более неожиданными являются различия в скорости потока видели между синусоиды, которые бок о бок и колебания видели в отдельных сосудистых сегментов в течение нескольких секунд. STAFF является мощным новым инструментом, способным обеспечить новые идеи, позволяя измерения сложной пространственно-временной динамики капиллярного потока.
Introduction
Микроваскулатура играет важную роль в физиологии, обеспечивая эффективную перфузию тканей в изменяющихся условиях. Микрососудистая дисфункция связана с множеством заболеваний, включая длительную сердечно-сосудистую заболеваемость и смертность, развитие деменции, а также заболевания печени и почек и, таким образом, является ключевым фактором интереса в широком диапазоне биомедицинских исследований1,2,3,4,5. В то время как для оценки перфузии тканей используются многочисленные методы, только интравитальная микроскопия позволяет собирать данные в височном и пространственном разрешении, необходимом для характеристики кровотока на уровне отдельных капилляров.
Микрососудистый поток может быть визуализирован в флуоресценционной микроскопии либо движением флуоресцентных микросфер, либо движением красных кровяных телец на фоне мембранно-непроницаемых флуоресцентных маркеров (например, флуоресцентно маркированных экстран или альбумина)6,7. Микрососудистый поток можно изображениять в поверхностных слоях клеток с помощью широкоугольной микроскопии, или на глубине с помощью конфокальной или многофотонной микроскопии. Тем не менее, скорость капиллярного потока такова, что прохождение красных кровяных телец, как правило, не может быть захвачен о скорости менее 60 кадров/с. Поскольку большинство лазерных сканирования конфокальных и мультифотонных микроскопов требуют 1-5 с для сканирования полного поля изображения, эта скорость, как правило, может быть достигнуто только путем ограничения поля зрения, иногда одной линии сканирования8. Процесс ограничения измерений отдельными сегментами капилляров (1) может привести к смещению выбора и (2) делает невозможным фиксацию пространственной и временной неоднородности в темпах капиллярного кровотока. В отличие от этого, изображения капиллярных сетей могут быть собраны со скоростью, превышающей 100 кадров в секунду с помощью широкоугольных цифровых микроскопов, оснащенных научными дополнительными полупроводниковыми камерами оксида металла (sCMOS)9,10. Эти недорогие системы, распространенные в типичных биомедицинских лабораториях, позволяют образовать микрососудистый поток по всей двумерной сети, по существу непрерывно. Таким образом, проблема заключается в поиске аналитического подхода, способного извлекать значимые количественные данные из массивных и сложных наборов данных изображений, генерируемых высокоскоростной видеомикроскопией.
Для анализа данных полного потока мы разработали STAFF, новое программное обеспечение для анализа изображений, которое может непрерывно измерять микрососудистый поток по всему микроскопу полей серии изображений, собранных на высокой скорости11. Этот подход совместим с различными экспериментальными системами и методами визуализации, а программное обеспечение для анализа изображений STAFF реализовано в качестве макроинструмента для реализации FIJI ImageJ12. Основополагающий принцип, используемый здесь для визуализации микрососудистого потока, заключается в том, что во-первых, необходимо обеспечить некоторый контраст, чтобы иметь возможность изображения красных кровяных телец в капиллярах. В наших исследованиях контраст обеспечивается объемным флуоресцентным зондом, который исключается красными кровяными тельцами. Скорость потока может быть количественно от смещения красных кровяных телец, которые появляются как отрицательное пятно в флуоресцентно помечены плазмы в изображениях, собранных на высокой скорости из живого животного8. Затем мы используем STAFF, чтобы сделать участки расстояния вдоль каждого сегмента капилляров в течение нескольких интервалов времени, называемых kymographs, затем обнаружить склоны, присутствующие в kymographs13, и с этих склонов вычислить скорость микрососудистого потока. Этот подход может быть применен к изображениям, собранным с любой капиллярной кровати, которые могут быть доступны для визуализации. Здесь мы описываем применение IVM и STAFF к изучению кровотока в печени.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе есть несколько критических шагов. Во-первых, минимизация движения во время интравитета изображения печени имеет важное значение для создания фильмов, которые могут использоваться для анализа капиллярного потока с помощью STAFF. Из-за близости диафрагмы, короткие период?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования, представленные здесь, были поддержаны финансированием со стороны Национальных институтов здравоохранения (NIH U01 GM11243 и NIH NIDDK P30 DK079312). Интравитальной микроскопии исследования были проведены в Индиане Центр биологической микроскопии. Мы благодарим доктора Малгожата Камока за техническую помощь в микроскопии.
Materials
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing .011x.024in |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2×2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 Ga.x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
References
- Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
- Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
- Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
- Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
- Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , (2012).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Huang, Z. -. L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156 (2011).
- Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Liu, Z. -. Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
- Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
- Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052 (2013).
- Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106 (2013).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303 (2015).
- Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), 416-425 (2016).
- Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341 (2014).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).
