Análisis temporal espacial del flujo de campo en la microvasculatura

Summary

Para cuantificar el flujo microvascular a partir de secuencias de imágenes de flujo capilar de alta velocidad, desarrollamos el software STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). A lo largo del campo de imagen completo y a lo largo del tiempo, STAFF evalúa las velocidades de flujo y genera una secuencia de mapas espaciales codificados por colores para la visualización y la salida tabular para análisis cuantitativos.

Abstract

Los cambios en la velocidad y distribución del flujo sanguíneo son vitales para mantener la perfusión de tejidos y órganos en respuesta a las diferentes necesidades celulares. Además, la aparición de defectos en la microcirculación puede ser un indicador principal en el desarrollo de múltiples patologías. Los avances en la imagen óptica han hecho de la microscopía intravital (IVM) un enfoque práctico, permitiendo la toma de imágenes a nivel celular y subcelular en animales vivos a alta velocidad en el tiempo. Sin embargo, a pesar de la importancia de mantener una perfusión de tejido adecuada, rara vez se documenta la variabilidad espacial y temporal en el flujo capilar. En el enfoque estándar, se elige un pequeño número de segmentos capilares para la toma de imágenes durante un tiempo limitado. Para cuantificar exhaustivamente el flujo capilar de una manera imparcial, desarrollamos el Análisis Temporal Espacial del Flujo Fieldwise (STAFF), una macro para el software de análisis de imágenes de código abierto fiji. Utilizando secuencias de imágenes de alta velocidad de campos completos de flujo sanguíneo dentro de los capilares, STAFF produce imágenes que representan movimiento a lo largo del tiempo llamados kymographs para cada intervalo de tiempo para cada segmento vascular. A partir de los kymographs, STAFF calcula las velocidades a partir de la distancia a la que se mueven los glóbulos rojos a lo largo del tiempo y genera los datos de velocidad como una secuencia de mapas espaciales codificados por colores para la visualización y la salida tabular para análisis cuantitativos. En los hígados de ratón normales, STAFF analiza las diferencias profundas cuantificadas en la velocidad de flujo entre las regiones pericentrales y periportal dentro de los lóbulos. Aún más inesperadas son las diferencias en la velocidad de flujo que se ven entre los sinusoides que están lado a lado y las fluctuaciones que se ven dentro de segmentos vasculares individuales durante segundos. STAFF es una nueva herramienta poderosa capaz de proporcionar nuevos conocimientos al permitir la medición de la compleja dinámica espaciotemporal del flujo capilar.

Introduction

La microvasculatura desempeña un papel crítico en la fisiología, asegurando la perfusión efectiva de los tejidos en condiciones cambiantes. La disfunción microvascular se asocia con innumerables afecciones, incluyendo la morbilidad cardiovascular y mortalidad a largo plazo, el desarrollo de la demencia y la enfermedad tanto del hígado como del riñón y, por lo tanto, es un factor clave de interés en una amplia gama de investigaciones biomédicas^1,2,3,4,5. Mientras que se han utilizado múltiples técnicas para evaluar la perfusión tisular, sólo la microscopía intravital permite la recopilación de datos a la resolución temporal y espacial necesaria para caracterizar el flujo sanguíneo a nivel de capilares individuales.

El flujo microvascular se puede visualizar en microscopía de fluorescencia ya sea por el movimiento de microesferas fluorescentes o por el movimiento de glóbulos rojos en el fondo de marcadores fluorescentes impermeant de membrana (por ejemplo, dextran o albúmina con etiqueta fluorescente)^6,7. El flujo microvascular se puede fotografiar en capas celulares superficiales utilizando microscopía de campo ancho, o a profundidad mediante microscopía confocal o multifotona. Sin embargo, los caudales capilares son tales que el paso de glóbulos rojos generalmente no se puede capturar a velocidades inferiores a 60 fotogramas/s. Dado que la mayoría de los microscopios confocales y multifotónicos de escaneo láser requieren 1–5 s para escanear un campo de imagen completo, esta velocidad generalmente se puede lograr sólo limitando el campo de visión, a veces a una sola línea de escaneo^8. El proceso de limitar las mediciones a segmentos capilares seleccionados (1) tiene el potencial de introducir sesgo de selección y (2) hace imposible capturar la heterogeneidad espacial y temporal en las tasas de flujo sanguíneo capilar. Por el contrario, las imágenes de redes capilares se pueden recoger a velocidades superiores a 100 fps utilizando microscopios digitales de campo ancho equipados con cámaras científicas complementarias complementarias de semiconductores de óxido metálico (sCMOS)^9,10. Estos sistemas baratos, comunes en los laboratorios biomédicos típicos, permiten crear imágenes del flujo microvascular a través de redes bidimensionales enteras, esencialmente de forma continua. El problema se convierte entonces en encontrar un enfoque de análisis que sea capaz de extraer datos cuantitativos significativos de los conjuntos de datos de imágenes masivos y complejos generados por la microscopía de vídeo de alta velocidad.

Para permitir el análisis de los datos de flujo de campo completo hemos desarrollado STAFF, un novedoso software de análisis de imágenes que puede medir continuamente el flujo microvascular a través de campos de microscopio completos de series de imágenes recopiladas a alta velocidad¹¹. El enfoque es compatible con una variedad de diferentes sistemas experimentales y modalidades de imagen y el software de análisis de imágenes STAFF se implementa como un conjunto de herramientas macro para la implementación FIJI de ImageJ^12. El principio subyacente utilizado aquí para visualizar el flujo microvascular es que, en primer lugar, se debe proporcionar cierto contraste para poder tomar imágenes de los glóbulos rojos dentro de los capilares. En nuestros estudios, el contraste es proporcionado por una sonda fluorescente a granel que es excluida por los glóbulos rojos. La velocidad del flujo se puede cuantificar a partir del desplazamiento de los glóbulos rojos que aparecen como una mancha negativa dentro del plasma etiquetado fluorescentemente en imágenes recogidas a alta velocidad de un animal vivo^8. A continuación, utilizamos STAFF para hacer parcelas de distancia a lo largo de cada segmento capilar en múltiples intervalos de tiempo llamados kymographs, luego detectamos las pendientes presentes en los^{kymographs 13,}y a partir de esas pendientes calcular las tasas de flujo microvascular. El enfoque se puede aplicar a las imágenes recogidas desde cualquier lecho capilar al que se pueda acceder para obtener imágenes. Aquí describimos la aplicación de IVM y STAFF a los estudios de flujo sanguíneo en el hígado.

Protocol

Todos los experimentos con animales fueron aprobados y llevados a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Indiana, y se adhirieron a la guía NRC para el cuidado y uso de animales. 1. Preparación quirúrgica para la microscopía intravital NOTA: Esto no es una cirugía de supervivencia. Una vez iniciada la sección 1 “Preparación quirúrgica para la microscopía intravital”, el …

Representative Results

El análisis de personal genera un censo completo de velocidades microvasculares en campos de microscopio según el período de tiempo que se extiende de segundos a minutos. Los resultados representativos se presentan en la Figura 1, la Figura 2, la Figura 3y la Figura 4. La Figura 1 muestra un ejemplo de una serie temporal de la red microvascular en el hígado de un ratón…

Discussion

Hay varios pasos críticos en este protocolo. En primer lugar, la minimización del movimiento durante la toma de imágenes intravitales del hígado es esencial para generar películas que se pueden utilizar para el análisis de flujo capilar utilizando STAFF. Debido a la proximidad del diafragma, se producen períodos cortos de movimiento inducido por la respiración, con el hígado asegurado regresando a su posición inicial después de cada respiración. Asegurar el hígado expuesto quirúrgicamente contra el plato co…

Materials

#5 forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5 Inox Forceps
C57BL/6 mice	Jackson Labs		male 9-12 weeks old
Cannula	Instech	BTPE-10	Polyethylene Tubing .011x.024in
CMOS camera	Hamamatsu	C11440-42U30	4.0LT Scientific CMOS
Coverslip-bottomed dish	Electron Microscopy Sciences		WillCo Dish glass bottom GWST5040
Dissecting scissors	Fine Science Tools
Fiji ImageJ Image analysis software			https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip
Fluorescein dextran	Thermo Fisher, Invitrogen	D1822	Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable
Gauze sponge	Fisher	22-415-504	2×2 inch Dukal sterile gauze sponges
Heating pad	Reptitherm	RH-4	between mouse and stage
Heating pad	Sunbeam	000732-500-000U	over mouse
Inverted epifluorescence microscope	Nikon		Nikon TiE inverted microscope
Isis Rodent electric shaver	Braun Aesculap	GT420
Isofluorane	Abbott GmbH	PZN4831850
Luer stub adapter	Fisher	14-826-19E	Catheter adapter
Micro scissors	Castro Viejo
Microscope objective	Nikon		Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion
Needle	Fisher		30 Ga.x1/2"
Needle holder	Olsen-Hegar
Objective heater	BioScience Tools	MTC-HLS-025	Temperature controller with objective heater
Rectal thermometer	Braintree Scientific, INC	TH-5A	Mouse Body Temperature monitoring
STAFF macros			https://github.com/icbm-iupui/STAFF
Suture string	Harvard Bioscience	723288	silk black suture, 6-0, spool