Rumlig tidsmæssig analyse af Fieldwise flow i Microvasculature
Summary
For at kvantificere microvaskulære flow fra high speed kapillar flow billedsekvenser, vi udviklede personale (Spatial tidsmæssig analyse af Fieldwise flow) software. På tværs af hele billedfeltet og over tid evaluerer medarbejderne flowhastigheder og genererer en sekvens af farvekodede rumkort til visualisering og tabel output til kvantitative analyser.
Abstract
Ændringer i blodgennemstrømningen hastighed og distribution er afgørende for at opretholde væv og organ perfusion som reaktion på varierende cellulære behov. Desuden kan forekomsten af defekter i mikrocirkulationen være en primær indikator i udviklingen af flere patologier. Fremskridt inden for optisk billeddannelse har gjort intravital mikroskopi (IVM) en praktisk tilgang, der tillader billeddannelse på cellulært og subcellulært niveau i levende dyr ved høj hastighed over tid. Men på trods af vigtigheden af at opretholde tilstrækkelig vævs perfusion, er rumlig og tidsmæssig variation i kapillar strømmen sjældent dokumenteret. I standardmetoden vælges et lille antal kapillar segmenter til billeddannelse over en begrænset periode. For at kvantificere kapillar strømmen på en objektiv måde udviklede vi rumlig tidsmæssig analyse af Fieldwise flow (STAFF), en makro til FIJI open-source billedanalyse software. Ved hjælp af High-Speed billedsekvenser af fulde felter af blodgennemstrømning i kapillærer, personale producerer billeder, der repræsenterer bevægelse over tid kaldet kymographs for hvert tidsinterval for hvert vaskulære segment. Fra kymographs personale beregner hastigheder fra afstanden, at røde blodlegemer bevæger sig over tid, og output hastighed data som en sekvens af farvekodede rumlige kort til visualisering og tabel output for kvantitative analyser. I normale muselever analyserer medarbejderne kvantificerede dybe forskelle i strømningshastigheden mellem nekrose-og Portal-områder inden for lobuler. Endnu mere uventet er forskellene i strømningshastigheden set mellem sinusoider, der er side om side og udsving set inden for individuelle vaskulære segmenter over sekunder. PERSONALE er et kraftfuldt nyt værktøj, der kan give nye indblik ved at muliggøre måling af den komplekse spatiotemporale dynamik i kapillar strømmen.
Introduction
Mikrovaskulaturen spiller en afgørende rolle i fysiologi, der sikrer effektiv perfusion af væv under skiftende forhold. Microvaskulær dysfunktion er forbundet med utallige betingelser, herunder langvarig kardiovaskulær morbiditet og dødelighed, udvikling af demens, og sygdom i både lever og nyrer og dermed er en nøglefaktor for interesse i en bred vifte af biomedicinske undersøgelser1,2,3,4,5. Mens flere teknikker er blevet brugt til at evaluere vævs perfusion, kun intravital mikroskopi muliggør dataindsamling ved den tidsmæssige og rumlige opløsning er nødvendig for at karakterisere blodgennemstrømning på niveauet af individuelle kapillærer.
Microvaskulær flow kan visualiseres i Fluorescens mikroskopi enten ved bevægelse af fluorescerende mikrosfærer eller ved bevægelse af røde blodlegemer på baggrund af membran-Imper-umærkede lysstofrør (f. eks. fluorercently-mærket dextran eller albumin)6,7. Microvaskulær flow kan afbildet i overfladiske cellelag ved hjælp af widefield mikroskopi, eller i dybden ved hjælp af enten Konfokal eller multifoton mikroskopi. Men, kapillar strømningshastigheder er sådan, at passagen af røde blodlegemer generelt ikke kan fanges ved hastigheder mindre end 60 frames/s. Da de fleste Laserscanning konfokale og multiphoton mikroskoper kræver 1-5 s at scanne en fuld billedfelt, denne hastighed kan generelt kun opnås ved at begrænse synsfeltet, nogle gange til en enkelt scanning linje8. Processen med at begrænse målinger til udvalgte kapillar segmenter (1) har potentialet til at indføre selektionsbias og (2) gør det umuligt at indfange rumlige og tidsmæssige heterogenitet i satserne for kapillærblod gennemstrømning. I modsætning hertil kan billeder af kapillar netværk indsamles ved hastigheder over 100 fps ved hjælp af widefield digitale mikroskoper udstyret med videnskabelige komplementære metaloxid halvleder (scmos) kameraer9,10. Disse billige systemer, almindelige i typiske biomedicinske laboratorier gør det muligt at billede microvaskulære flow på tværs af hele todimensionelle netværk, hovedsagelig kontinuerligt. Problemet bliver så en af at finde en analyse tilgang, der er i stand til at udtrække meningsfulde kvantitative data fra de massive og komplekse billeddatasæt genereret af high-speed video mikroskopi.
For at muliggøre analyse af data for fuld felt flow har vi udviklet medarbejdere, nye billedanalyse software, der kontinuerligt kan måle microvaskulær flow i hele mikroskop felter af billedserier indsamlet ved høj hastighed11. Tilgangen er kompatibel med en række forskellige eksperimentelle systemer og billedbehandlings metoder og de ansatte billedanalyse software er implementeret som en makro værktøjsæt til FIJI implementering af ImageJ12. Det underliggende princip, der anvendes her til at visualisere microvaskulære flow er, at første, nogle kontrast skal gives for at kunne billede de røde blodlegemer i kapillærer. I vores undersøgelser, kontrast er tilvejebragt af en bulk fluorescerende sonde, der er udelukket af de røde blodlegemer. Hastigheden af strømmen kan derefter kvantificeres fra forskydningen af de røde blodlegemer, der vises som en negativ plet i fluorescently mærket plasma i billeder indsamlet ved høj hastighed fra et levende dyr8. Vi bruger derefter personale til at gøre observationsområder langs hvert kapillar segment over flere intervaller af tid kaldet kymographs, derefter opdage de skråninger, der findes i kymographs13, og fra disse skråninger beregne satserne for microvaskulære flow. Tilgangen kan anvendes på billeder indsamlet fra enhver kapillær seng, der kan tilgås til Imaging. Her beskriver vi anvendelsen af IVM og personale til undersøgelser af blodgennemstrømningen i leveren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er flere kritiske trin i denne protokol. Første, minimering af bevægelse under intravital billeddannelse af leveren er afgørende for at generere film, der er brugbare til kapillar flow analyse ved hjælp af personale. På grund af nærhed af membranen, korte perioder af respiration-induceret bevægelse opstår, med den sikrede leveren vender tilbage til sin oprindelige position efter hver åndedræt. Sikring af kirurgisk eksponeret lever mod coverslip-bunden skålen ved hjælp af gaze, derefter billeddannelse nede…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Undersøgelser præsenteret her blev støttet af finansiering fra National Institutes of Health (NIH U01 GM111243 og NIH NIDDK P30 DK079312). Intravital mikroskopi undersøgelser blev udført på Indiana Center for biologisk mikroskopi. Vi takker Dr. Malgorzata Kamocka for teknisk assistance med mikroskopi.
Materials
| #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 Inox Forceps |
| C57BL/6 mice | Jackson Labs | male 9-12 weeks old | |
| Cannula | Instech | BTPE-10 | Polyethylene Tubing .011x.024in |
| CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U30 | 4.0LT Scientific CMOS |
| Coverslip-bottomed dish | Electron Microscopy Sciences | WillCo Dish glass bottom GWST5040 | |
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | ||
| Fiji ImageJ Image analysis software | https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip | ||
| Fluorescein dextran | Thermo Fisher, Invitrogen | D1822 | Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable |
| Gauze sponge | Fisher | 22-415-504 | 2×2 inch Dukal sterile gauze sponges |
| Heating pad | Reptitherm | RH-4 | between mouse and stage |
| Heating pad | Sunbeam | 000732-500-000U | over mouse |
| Inverted epifluorescence microscope | Nikon | Nikon TiE inverted microscope | |
| Isis Rodent electric shaver | Braun Aesculap | GT420 | |
| Isofluorane | Abbott GmbH | PZN4831850 | |
| Luer stub adapter | Fisher | 14-826-19E | Catheter adapter |
| Micro scissors | Castro Viejo | ||
| Microscope objective | Nikon | Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion | |
| Needle | Fisher | 30 Ga.x1/2" | |
| Needle holder | Olsen-Hegar | ||
| Objective heater | BioScience Tools | MTC-HLS-025 | Temperature controller with objective heater |
| Rectal thermometer | Braintree Scientific, INC | TH-5A | Mouse Body Temperature monitoring |
| STAFF macros | https://github.com/icbm-iupui/STAFF | ||
| Suture string | Harvard Bioscience | 723288 | silk black suture, 6-0, spool |
References
- Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
- Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
- Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
- Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
- Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
- Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , (2012).
- von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
- Huang, Z. -. L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156 (2011).
- Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Liu, Z. -. Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369 (1991).
- Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
- Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
- Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
- Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
- Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
- Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052 (2013).
- Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106 (2013).
- Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303 (2015).
- Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), 416-425 (2016).
- Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341 (2014).
- Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).
