Romlig Temporal analyse av Fieldwise Flow i Microvasculature

Summary

For å kvantifisere mikrovaskulær Flow fra høyhastighets kapillær Flow bildesekvenser, utviklet vi STAFF (romlig Temporal Analysis of Fieldwise flow) programvare. Over hele bildet feltet og over tid, ansatte evaluerer Flow hastigheter og genererer en sekvens av fargekodede romlige kart for visualisering og tabell produksjon for kvantitative analyser.

Abstract

Endringer i blodgjennomstrømningen hastighet og distribusjon er avgjørende for å opprettholde vev og organ blod som svar på varierende cellulære behov. Videre kan utseendet på defekter i mikrosirkulasjonen være en primær indikator i utviklingen av flere patologi. Fremskritt inne optisk tenkelig ha fremstilt intravital mikroskopi (IVM) en praktisk adgang, tillater tenkelig for det Cellular og subcellulære plan flate inne bo dyrene for høy-fart over tid. Likevel, til tross for viktigheten av å opprettholde tilstrekkelig vev, er romlig og timelig variasjon i kapillær flyt sjelden dokumentert. I standard tilnærmingen velges et lite antall kapillær segmenter for bildebehandling over en begrenset periode. Til omfattende kvantifisere kapillær flyt på en upartisk måte vi utviklet romlig Temporal analyse av Fieldwise Flow (STAFF), en makro for FIJI åpen kildekode bildeanalyse programvare. Ved hjelp av høyhastighets bildesekvenser av hele felt av blodstrøm innen blodkar, produserer STAFF bilder som representerer bevegelse over tid kalt kymographs for hvert tidsintervall for hvert vaskulær segment. Fra kymographs STAFF beregner hastigheter fra avstanden som røde blodlegemer beveger seg over tid, og utganger hastigheten data som en sekvens av fargekodede romlige kart for visualisering og tabell produksjon for kvantitative analyser. I normale mus lever, STAFF analyser kvantifisert dype forskjeller i strømningshastighet mellom pericentral og periportal regioner innen lobules. Enda mer uventede er forskjellene i strømningshastighet sett mellom sinusoids som er side ved side og svingninger sett innenfor individuelle vaskulær segmenter over sekunder. STAFF er et kraftig nytt verktøy som kan gi romanen innsikt ved å muliggjøre måling av komplekse spatiotemporal dynamikk av kapillær flyt.

Introduction

Microvasculature spiller en avgjørende rolle i fysiologi, noe som sikrer effektiv mengde vev under skiftende forhold. Mikrovaskulær dysfunksjon er assosiert med utallige forhold inkludert langsiktige kardiovaskulære sykelighet og dødelighet, utvikling av demens, og sykdom i både lever og nyre, og dermed er en viktig faktor av interesse i et bredt spekter av biomedisinsk undersøkelser^1,2,3,4,5. Mens flere teknikker har blitt brukt til å evaluere vev, bare intravital mikroskopi muliggjør datainnsamling ved Temporal og romlig oppløsning er nødvendig for å karakterisere blodstrømmen på nivået av individuelle blodkar.

Mikrovaskulær Flow kan bli visualisere i fluorescens mikroskopi enten ved bevegelse av fluorescerende mikrosfærer eller ved bevegelse av røde blodlegemer på bakgrunn av membran-impermeant fluorescerende markører (f. eks, fluorescensmerkete-merket dextran eller albumin)^6,7. Mikrovaskulær Flow kan bli avbildet i overfladiske celle lag ved hjelp av widefield mikroskopi, eller i dybden ved hjelp av enten konfokalmikroskopi eller multiphoton mikroskopi. Men kapillær strømningsrater er slik at passering av røde blodlegemer ikke kan generelt bli fanget i hastigheter mindre enn 60 rammer/s. Siden de fleste laserskanning konfokalmikroskopi og multiphoton mikroskop krever 1-5 s for å skanne et fullstendig bildefelt, kan denne hastigheten generelt oppnås bare ved å begrense synsfeltet, noen ganger til en enkelt skanning linje⁸. Prosessen med å begrense målingene til utvalgte kapillær segmenter (1) har potensiale til å innføre utvalgs bias og (2) gjør det umulig å fange romlige og timelige heterogenitet i utbredelsen av kapillær blodstrøm. I kontrast kan bilder av kapillær nettverk samles ved hastigheter som overstiger 100 fps bruker widefield Digital mikroskop utstyrt med vitenskapelige komplementære metalloksid Semiconductor (sCMOS) kameraer^9,10. Disse rimelige systemer, vanlig i typiske biomedisinsk laboratorier gjør det mulig å bilde mikrovaskulær flyt over hele todimensjonale nettverk, i hovedsak kontinuerlig. Problemet blir da en av å finne en analyse tilnærming som er i stand til å utvinne meningsfulle kvantitative data fra den massive og komplekse bildedata sett generert av høyhastighets video mikroskopi.

For å muliggjøre analyse av full felts flyt data har vi utviklet STAFF, romanen bildeanalyse programvare som kan kontinuerlig måle mikrovaskulær flyt gjennom hele mikroskop felt av bildeserier samlet i høy hastighet¹¹. Tilnærmingen er kompatibel med en rekke ulike eksperimentelle systemer og Imaging modaliteter og STAFF bildeanalyse programvare er implementert som en Makroverktøy sett for FIJI gjennomføringen av ImageJ¹². Det underliggende prinsippet som brukes her for å visualisere mikrovaskulær flyt er at først, må noen kontrast gis for å kunne bildet de røde blodcellene i blodkar. I våre studier, kontrasten er gitt av en bulk fluorescerende sonde som er utelukket av røde blodlegemer. Hastigheten av flyt kan da bli kvantifisert fra forskyvning av de røde blodcellene som vises som en negativ flekk i fluorescensmerkete merket plasma i bilder samlet i høy hastighet fra et levende dyr⁸. Vi bruker STAFF å gjøre tomter av avstand langs hver kapillær segment over flere tidsintervaller kalt kymographs, og deretter oppdage bakkene stede i kymographs¹³, og fra disse bakkene beregne utbredelsen av mikrovaskulær flyt. Tilnærmingen kan brukes på bilder som er samlet fra en kapillær seng som kan nås for Imaging. Her beskriver vi anvendelsen av IVM og STAFF til studier av blodstrømmen i leveren.

Protocol

Alle dyr eksperimenter ble godkjent og gjennomført i henhold til institusjonelle Animal Care og use Committee retningslinjer for Indiana University, og overholdt NRC guide for omsorg og bruk av dyr. 1. kirurgisk forberedelse til Intravital mikroskopi Merk: Dette er ikke en overlevelse kirurgi. Når del 1 “kirurgisk forberedelse for intravital mikroskopi” er påbegynt, kan arbeidet ikke stanses før ferdigstillelse av § 2 “Intravital mikroskopi”….

Representative Results

STAFF-analyse genererer en fullstendig folketelling av mikrovaskulær hastigheter over hele mikroskop felt overtids perioder som strekker seg fra sekunder til minutter. Representative resultater presenteres i figur 1, figur 2, Figur 3og Figur 4. Figur 1 viser et eksempel på en tidsserie av mikrovaskulær nettverket i leveren av en mus, generering av skeletonized bildet som…

Discussion

Det er flere kritiske trinn i denne protokollen. Først, minimering av bevegelse under intravital Imaging av leveren er avgjørende for generering av filmer som er brukbare for kapillær Flow analyse bruker STAFF. På grunn av nærheten til membranen, korte perioder med åndedrett-indusert bevegelse oppstår, med sikret leveren tilbake til sin opprinnelige posisjon etter hvert åndedrag. Sikring av kirurgisk eksponert leveren mot dekkglass-bunn parabolen bruker gasbind, deretter Imaging fra nedenfor ved hjelp av en inver…

Materials

#5 forceps	Fine Science Tools	11251-20	Dumont #5 Inox Forceps
C57BL/6 mice	Jackson Labs		male 9-12 weeks old
Cannula	Instech	BTPE-10	Polyethylene Tubing .011x.024in
CMOS camera	Hamamatsu	C11440-42U30	4.0LT Scientific CMOS
Coverslip-bottomed dish	Electron Microscopy Sciences		WillCo Dish glass bottom GWST5040
Dissecting scissors	Fine Science Tools
Fiji ImageJ Image analysis software			https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip
Fluorescein dextran	Thermo Fisher, Invitrogen	D1822	Dextran, Fluorescein, 70,000 MW, Anionic, Lysine Fixable
Gauze sponge	Fisher	22-415-504	2×2 inch Dukal sterile gauze sponges
Heating pad	Reptitherm	RH-4	between mouse and stage
Heating pad	Sunbeam	000732-500-000U	over mouse
Inverted epifluorescence microscope	Nikon		Nikon TiE inverted microscope
Isis Rodent electric shaver	Braun Aesculap	GT420
Isofluorane	Abbott GmbH	PZN4831850
Luer stub adapter	Fisher	14-826-19E	Catheter adapter
Micro scissors	Castro Viejo
Microscope objective	Nikon		Plan Fluor 20x, NA 0.75 water immersion
Needle	Fisher		30 Ga.x1/2"
Needle holder	Olsen-Hegar
Objective heater	BioScience Tools	MTC-HLS-025	Temperature controller with objective heater
Rectal thermometer	Braintree Scientific, INC	TH-5A	Mouse Body Temperature monitoring
STAFF macros			https://github.com/icbm-iupui/STAFF
Suture string	Harvard Bioscience	723288	silk black suture, 6-0, spool