Forhøyede spinalvæske proteinnivåer kan enten være et resultat av diffusjon av plasma protein over en endret blod-hjerne barriere eller intratekal syntese. En optimalisert test protokollen er presentert i denne artikkelen som bidrar til å diskriminere begge tilfeller og gir kvantitative målinger av intratekalt syntetisert proteiner.
Spinalvæske (CSF), en væske som finnes i hjernen og ryggmargen, er av stor betydning for både grunnleggende og klinisk vitenskap. Analysen av CSF protein sammensetning leverer viktig informasjon i grunnleggende nevrovitenskap forskning så vel som nevrologiske sykdommer. En påminnelse er at proteiner målt i CSF kan utlede fra både intratekal syntese og transudation fra serum, og proteinanalyse av CSF kan bare bestemme summen av disse to komponentene. Å diskriminere mellom protein transudation fra blodet og intratekalt produserte proteiner i dyremodeller så vel som hos mennesker, CSF protein profilering målinger ved hjelp av konvensjonelle proteinanalyse verktøy må inkludere beregning av albumin CSF/serum kvotienten (Qalbumin), en markør for integriteten av blod-hjerne-GRENSESNITTET (bbI), og protein indeksen (Qprotein/qalbumin), et anslag på intratekal proteinsyntese. Denne protokollen illustrerer hele prosedyren, fra CSF og blod samling til kvotienter og indekser beregninger, for kvantitativ måling av intratekal proteinsyntese og BBI svekkelse i musen modeller av nevrologiske lidelser.
Spinalvæske (CSF), en klar og fargeløs væske rundt hjernen og ryggmargen, har stor klinisk og grunnleggende vitenskapelig betydning. CSF bevarer det elektrolytisk miljøet i sentralnervesystemet (CNS), balanserer systemisk syre-base-status, leverer næringsstoffer til neuronal og gliacellene celler, fungerer som et lymfesystemet for CNS, og transporterer hormoner, nevrotransmittere, cytokiner og andre nevropeptider i hele CNS1. Således, som CSF sammensetningen reflekterer aktiviteten til CNS, tilbyr denne væsken en verdifull, men indirekte, tilgang til å karakterisere den fysiologiske og patologiske tilstand av CNS.
CSF har blitt brukt til å diagnostisere forhold som påvirker CNS i over hundre år, og for det meste av denne tiden, ble det først og fremst studert av klinikere som et diagnostisk verktøy. Men i de senere årene neurobiologists har anerkjent potensialet i CSF for å studere patofysiologi av CNS. Spesielt har flere høy gjennomstrømming proteinanalyse verktøy blitt innført i nevrovitenskap riket slik at en detaljert studie av protein sammensetningen av CSF, med en forventning om at denne analysen kan bidra til å gi innsikt i de dynamiske endringene som oppstår i CNS.
Teknologisk utvikling i multiplex immunanalysen teknikker som Luminex og Simoa Technologies2,3, gir forskerne i dag med evnen til å oppdage hundrevis av proteiner ved svært lave konsentrasjoner. Videre, de samme teknologiene tillater bruk av små prøve volumer, og dermed fremme studier i små dyr, inkludert mus, der begrenset utvalg volumer av CSF har utelukket detaljerte characterizations av væsken inntil nylig.
Likevel, en påminnelse er at proteiner målt i CSF kan utlede fra intratekal syntese og/eller transudation fra serum på grunn av en skadet blod-hjerne-grensesnitt (BBI). Dessverre kan proteinanalyse av CSF alene bare bestemme summen av disse to komponentene. For å diskriminere mellom transudat og intratekalt produserte proteiner, må CSF protein målinger ved hjelp av et tilgjengelig proteinanalyse verktøy justeres for individuell variasjon i serumkonsentrasjoner, samt barriere integritet. Men selv om denne justeringen brukes ofte i klinisk praksis, for eksempel CSF IgG-indeksen, som har høy følsomhet for å oppdage intratekal IgG syntese4,5,6, hittil svært få forskningsstudier har korrigert CSF protein konsentrasjoner for serumkonsentrasjon og barriere integritet7,8.
Foreløpig er Reibergram tilnærmingen den beste måten å bestemme barrierefunksjon og intratekal syntese av proteiner. Det er en grafisk evaluering i CSF/serum kvotienten diagrammer som analyserer, på en integrert måte, både barrieren (Dys) funksjon og intratekal proteinsyntese, med henvisning til en utelukkende blod-avledet protein9,10. Den svært rikelig protein albumin er vanligvis valgt som referanse protein fordi det er produsert bare i leveren og fordi størrelsen, ca 70 kDa, er middels mellom små og store proteiner11. Analysen diagrammet ble først definert av Reiber og Felgenhauer i 1987 for de store klassene av immunglobuliner (igs)11, som empirisk basert på resultatene Hentet fra analyse av tusenvis av menneskelige prøver9. Tilnærmingen ble senere bekreftet av anvendelsen av de to Fick ‘ s lover diffusjon i teorien om molekylær diffusjon/flow rate12. En slik teori demonstrerer spredningen av et protein gjennom barrieren har en hyperbolske fordeling og kan kvantitativt forklare dynamikken av proteiner i CNS9,13. Samlet sett er fordelen med å bruke Reibergram for å demonstrere intratekal proteinsyntese at det samtidig identifiserer protein fraksjon som kommer inn i CSF fra serum samt mengden protein som finnes i CSF på grunn av lokal produksjon.
Den nåværende artikkelen og den relaterte protokollen beskriver hele prosedyren, fra CSF og blod samling til den endelige beregningene korrigere CSF proteinnivåer, for den kvantitative måling av intratekal proteinsyntese i musemodeller av nevrologiske Lidelser. Denne prosedyren gir en Baseline mot å vurdere (1) den patofysiologiske opprinnelsen til noen CSF protein og (2) stabilitet og funksjonell betydning av barriere integritet. Denne prosedyren og protokollen er ikke bare nyttig for å vurdere musen CSF prøver, men er også nyttig i å analysere CSF i en rekke dyremodeller av nevrologiske sykdommer og menneskelige pasienter.
Kvantitative metoder for evaluering av økt CSF protein konsentrasjoner er nyttige verktøy i karakterisering av fysiologiske og patologiske tilstand av CNS. Men utover pålitelig kvantifisering av CSF proteinnivåer, påvisning av CSF proteiner krever et uttrykk for resultater som diskriminerer mellom blod-og CNS-avledet fraksjoner i CSF. Men hittil har de ofte brukte protein kvantifisering analysene ikke tillater diskriminering mellom de to protein komponentene, selv ved hjelp av høy gjennomstrømming verktøy. Derfor…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker personalet på Center for sammenlignende medisin og forskning (CCMR) på Dartmouth for deres eksperthjelp av musene som brukes for disse studiene. Den Bornstein Research Fund finansiert denne forskningen.
1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
1 mL syringe | BD | 329622 | |
25 gauge needle | BD | 305122 | |
3 mL syringe | BD | 309582 | |
30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
Absorbent pads | Any suitable brand | ||
Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
Ethanol | Kopter | V1001 | |
Freezer | VWR | VWR32086A | |
Gauze | Medline | NON25212 | |
Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
Induction Chamber | VETEQUIP | ||
Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt – 1 mm |
Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
Polyethylene tubing | |||
Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
Scale | Uline | H2716 | |
Scalpel | Feather | EF7281 | |
Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |