Summary

Kwantitatieve meting van Intrathecaal gesynthetiseerde eiwitten bij muizen

Published: November 29, 2019
doi:

Summary

Verhoogde ruggenmergvloeistof eiwit niveaus kunnen ofwel het resultaat van diffusie van plasma eiwit over een veranderde bloed-hersen barrière of intrathecale synthese. Een geoptimaliseerd testprotocol wordt in dit artikel gepresenteerd dat helpt om beide gevallen te discrimineren en kwantitatieve metingen van intrathecaal gesynthetiseerde eiwitten verschaft.

Abstract

Cerebrospinale vloeistof (CSF), een vloeistof gevonden in de hersenen en het ruggenmerg, is van groot belang voor zowel de basis-als de klinische wetenschap. De analyse van de CSF-eiwit samenstelling levert cruciale informatie in fundamenteel neurowetenschappelijk onderzoek en neurologische ziekten. Een voorbehoud is dat eiwitten gemeten in CSF kunnen voortvloeien uit intrathecale synthese en transudatie uit serum, en eiwitanalyse van CSF kan alleen de som van deze twee componenten bepalen. Om onderscheid te maken tussen eiwit transudatie uit het bloed en intrathecaal geproduceerde eiwitten in diermodellen en bij mensen, de metingen van het CSF-eiwit profiel met behulp van conventionele eiwitanalyse hulpmiddelen moeten de berekening omvatten van het albumine CSF/serum quotiënt (Q-albumine), een marker van de integriteit van de bloed-hersen interface (BBI) en de eiwit index (q-eiwit/q-albumine), een schatting van intrathecale eiwitsynthese. Dit protocol illustreert de gehele procedure, van CSF en bloedinzameling tot quotiënten en indices berekeningen, voor de kwantitatieve meting van intrathecale eiwitsynthese en de beperking van BBI in muismodellen van neurologische aandoeningen.

Introduction

Cerebrospinale vloeistof (CSF), een heldere en kleurloze vloeistof rond de hersenen en het ruggenmerg, houdt grote klinische en fundamentele wetenschappelijke betekenis. De CSF behoudt de elektrolytische omgeving van het centrale zenuwstelsel (CNS), balanceert de systemische zuur-base status, levert voedingsstoffen aan neuronale en gliale cellen, functioneert als een lymfatisch systeem voor het CZS, en vervoert hormonen, neurotransmitters, cytokines en andere neuropeptiden in het CZS1. Dus, aangezien de CSF-samenstelling de activiteit van het CZS weerspiegelt, biedt deze vloeistof een waardevolle, hoewel indirecte, toegang om de fysiologische en pathologische toestand van het CZS te karakteriseren.

CSF is gebruikt voor de diagnose van aandoeningen die invloed hebben op het CNS voor meer dan honderd jaar, en voor de meeste van deze tijd, het werd voornamelijk bestudeerd door clinici als een diagnostisch instrument. In de afgelopen jaren hebben neuro biologen echter het potentieel van CSF erkend voor het bestuderen van de pathofysiologie van het CZS. In het bijzonder zijn er verschillende eiwitanalyse hulpmiddelen met hoge doorvoer geïntroduceerd in het neurowetenschaprijk, waardoor een gedetailleerde studie van de eiwit samenstelling van het CSF mogelijk is, met de verwachting dat deze analyse kan helpen om inzicht te geven in de dynamische veranderingen die zich binnen het CZS voordoen.

Technologische ontwikkelingen in multiplex immunoassay technieken zoals luminex en simoa Technologies2,3, bieden onderzoekers vandaag de mogelijkheid om honderden eiwitten te detecteren bij zeer lage concentraties. Bovendien maken deze zelfde technologieën het gebruik van kleine monsterhoeveelheden mogelijk, waardoor studies bij kleine dieren, waaronder muizen, worden bevorderd, waarbij beperkte monstervolumes van CSF tot voor kort de gedetailleerde kenmerken van de vloeistof hebben uitgesloten.

Niettemin is een voorbehoud dat eiwitten gemeten in CSF kunnen voortvloeien uit intrathecale synthese en/of transudatie uit het serum als gevolg van een beschadigde bloed-hersen interface (BBI). Helaas, eiwitanalyse van CSF alleen kan alleen de som van deze twee componenten te bepalen. Om onderscheid te maken tussen transudaat en intrathecaal geproduceerde eiwitten, moeten de CSF-eiwit metingen met behulp van een beschikbare proteïne-Analysetool worden aangepast voor individuele variabiliteit in serumconcentraties en barrière-integriteit. Hoewel deze aanpassing vaak wordt gebruikt in de klinische praktijk, bijvoorbeeld de CSF IgG-index, die een hoge gevoeligheid heeft voor het opsporen van intrathecale IgG-synthese4,5,6, hebben tot op heden zeer weinig onderzoeken de CSF-eiwit concentraties gecorrigeerd voor de serumconcentratie en barrière-integriteit7,8.

Momenteel is de Reibergram aanpak de beste manier om de barrièrefunctie en intrathecale synthese van eiwitten te bepalen. Het is een grafische evaluatie in CSF/serum quotiënt diagrammen die, op een geïntegreerde manier, zowel de barrière (dys) functie en intrathecale eiwitsynthese analyseert, verwijzend naar een uitsluitend bloed-afgeleid eiwit9,10. De zeer overvloedige eiwit albumine wordt meestal gekozen als referentie-eiwit omdat het alleen in de lever wordt geproduceerd en omdat de grootte, ongeveer 70 kDa, intermediair is tussen kleine en grote eiwitten11. Het analyseschema werd voor het eerst gedefinieerd door Reiber en Felgenhauer in 1987 voor de belangrijkste klassen van immunoglobulinen (IGS)11, empirisch gebaseerd op de resultaten verkregen uit de analyse van duizenden menselijke monsters9. De aanpak werd vervolgens bevestigd door de toepassing van de twee Fick-wetten van diffusie in de theorie van de Moleculaire diffusie/debiet12. Een dergelijke theorie toont aan dat de diffusie van een eiwit door de barrière een hyperbolische verdeling heeft en de dynamiek van eiwitten in het CZS9,13kwantificatief kan verklaren. Over het algemeen is het voordeel van het gebruik van het Reibergram voor het aantonen van intrathecale eiwitsynthese dat het gelijktijdig de eiwitfractie identificeert die de CSF uit het serum binnenkomt, evenals de hoeveelheid eiwit die in het CSF wordt aangetroffen vanwege lokale productie.

Het huidige artikel en het bijbehorende protocol beschrijven de hele procedure, van CSF en bloedafname tot de uiteindelijke berekeningen die de GSK-eiwit niveaus corrigeren, voor de kwantitatieve meting van intrathecale eiwitsynthese in muismodellen van neurologische Aandoeningen. Deze procedure vormt een basis voor de beoordeling (1) van de pathofysiologische oorsprong van elk CSF-eiwit en (2) de stabiliteit en de functionele betekenis van de barrière-integriteit. Deze procedure en het protocol zijn niet alleen nuttig voor het beoordelen van muis CSF-voorbeelden, maar zijn ook nuttig bij het analyseren van CSF in een veelheid van diermodellen van neurologische ziekten en menselijke patiënten.

Protocol

Alle werk van dieren maakt gebruik van protocollen die zijn beoordeeld en goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) bij Geisel school of Medicine bij Dartmouth. 1. inzameling van vloeistoffen Opmerking: zowel serum als CSF zijn vereist. Voor overleving en obductie zijn twee protocollen voor elke vloeistof verzameling nodig. Serum en CSF-inzameling met behulp van overlevings proceduresOpmerking: voor de collectie Surviva…

Representative Results

Dit representatieve experiment was bedoeld om de intrathecale synthese van IgG te vergelijken in twee klinisch relevante knaagdieren modellen van multiple sclerose (MS): de PLP139-151-geïnduceerde recidief experimentele auto-immune encefalomyelitis (R-EAE) en de chronische progressieve, Theiler Murine encefalomyelitis virus-geïnduceerde demyelinerende ziekte (tmev-IDD) R-EAE is een nuttig model voor het begrijpen van relapsing-reeft MS, terwijl het TMEV-IDD-model chronische progressieve MS1…

Discussion

Kwantitatieve methoden voor de evaluatie van verhoogde GSK-eiwit concentraties zijn nuttige hulpmiddelen bij de karakterisering van de fysiologische en pathologische toestand van het CZS. Afgezien van een betrouwbare kwantificering van het CSF-eiwitgehalte, vereist de opsporing van CSF-eiwitten echter een uitdrukking van de resultaten die discrimineert tussen in bloed en CNS afgeleide fracties in het CSF. Echter, tot nu toe, de veelgebruikte eiwit kwantificering assays niet toestaan discriminatie tussen de twee eiwit com…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs danken de medewerkers van het centrum voor vergelijkende geneeskunde en onderzoek (CCMR) bij Dartmouth voor hun deskundige verzorging van de muizen die voor deze studies werden gebruikt. Het onderzoeksfonds Bornstein financierde dit onderzoek.

Materials

1 mL insulin syringe BD 329650
1 mL syringe BD 329622
25 gauge needle BD 305122
3 mL syringe BD 309582
30 gauge insulin needle BD 305106
Absorbent pads Any suitable brand
Acepromazine Patterson Vet Supply Inc
BioPlex Handheld Magnetic Washer BioRad 171020100 Magnet
BioPlex MAGPIX Multiplex Reader BioRad 171015001
BioPlex Pro Flat Bottom Plates BioRad 171025001
Biotinilated detection antibody Any suitable source The antibody has to be directed against the species of the protein of interest.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A4503
Buprenorphine hydrochloride PAR Pharmaceutical NDC 42023-179-05
Capillary Tubes Sutter Instrument B100-75-10 OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller.
Centrifuge tube, 0.2 mL VWR 20170-012
Centrifuge tube, 0.5 mL VWR 87003-290
Centrifuge tube, 1.5 mL VWR 87003-294
Chlorhexidine diacetate Nolvasan E004272
Disposable pipettes tips Any suitable brand
Ear bars KOPF Instruments 1921 or 1922
Ethanol Kopter V1001
Freezer VWR VWR32086A
Gauze Medline NON25212
Heating pad Sunbeam XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch
Induction Chamber VETEQUIP
Isoflurane Patterson Vet Supply Inc NDC 14043-704-06
Ketamine (KetaVed) Patterson Vet Supply Inc
MagPlex Microspheres (antibody-coupled) BioRad Antibody-coupled magnetic bead
Microplate Shaker Southwest Scientific SBT1500
Microretractors Carfill Quality ACD-010 Blunt – 1 mm
Microsoft Office (Excel) Microsoft
MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel EMD Millipore MGAMMAG-300K Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids.
Mouse Albumin capture ELISA kit Novus Biological NBP2-60484 Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids.
Multichannel pipette Eppendorf 3125000060
Non-Sterile swabs MediChoice WOD1002 Need to be autoclaved for sterility
Oxygen AIRGAS OX USPEA
Pasteur Pippettes Fisher 13-678-20A 5 & 3/4"
PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen Patterson Vet 8695G P-3 Reverse Cutting, 18"
PE-Streptavidin BD Biosciences 554061
Pipetters Eppendorf Research seriers
Polyethylene tubing
Refrigerated Centrifuge Beckman Coulter ALLEGRA X-12R
Scale Uline H2716
Scalpel Feather EF7281
Shaver Harvard Apparatus 52-5204
Standard proteins Any suitable source The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest.
Stereotaxic instrument KOPF Instruments Model 900LS Standard Accessories
Sterile 1 x PBS Corning Cellgro 21-040-CV
Sterile saline Baxter 0338-0048-02 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP
Surgical Forceps Curved, 7 (2) Fine Science Tools 11271-30 Dumont
Surgical Scissors Fine Science Tools 14094-11 Stainless 25x
Vaporizer + Flow meter Moduflex Anhestesia Instruments
Vortex Fisher 02-215-414
Warming pad Kent Scientific Corporation RT-JR-20
Water Sonicator Cole Parmer EW-08895-01
Xylazine Patterson Vet Supply Inc

References

  1. Whedon, J. M., Glassey, D. Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance. Alternative Therapies in Health and Medicine. 15 (3), 54-60 (2009).
  2. Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer’s disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
  3. Barro, C., et al. Fluid biomarker and electrophysiological outcome measures for progressive MS trials. Multiple Sclerosis. 23 (12), 1600-1613 (2017).
  4. Tourtellotte, W. W., et al. Multiple sclerosis: measurement and validation of central nervous system IgG synthesis rate. Neurology. 30 (3), 240-244 (1980).
  5. Bonnan, M. Intrathecal IgG synthesis: a resistant and valuable target for future multiple sclerosis treatments. Multiple Sclerosis International. 2015, 296184 (2015).
  6. Reiber, H. Cerebrospinal fluid–physiology, analysis and interpretation of protein patterns for diagnosis of neurological diseases. Multiple Sclerosis. 4 (3), 99-107 (1998).
  7. DiSano, K. D., Linzey, M. R., Royce, D. B., Pachner, A. R., Gilli, F. Differential neuro-immune patterns in two clinically relevant murine models of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 109 (2019).
  8. Pachner, A. R., Li, L., Lagunoff, D. Plasma cells in the central nervous system in the Theiler’s virus model of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 232 (1-2), 35-40 (2011).
  9. Reiber, H. Flow rate of cerebrospinal fluid (CSF)–a concept common to normal blood-CSF barrier function and to dysfunction in neurological diseases. Journal of Neurological Sciences. 122 (2), 189-203 (1994).
  10. Reiber, H., Zeman, D., Kusnierova, P., Mundwiler, E., Bernasconi, L. Diagnostic relevance of free light chains in cerebrospinal fluid – The hyperbolic reference range for reliable data interpretation in quotient diagrams. Clinica Chimica Acta. 497, 153-162 (2019).
  11. Reiber, H., Felgenhauer, K. Protein transfer at the blood cerebrospinal fluid barrier and the quantitation of the humoral immune response within the central nervous system. Clinica Chimica Acta. 163 (3), 319-328 (1987).
  12. Dorta-Contreras, A. J. Reibergrams: essential element in cerebrospinal fluid immunological analysis. Revista de Neurologia. 28 (10), 996-998 (1999).
  13. Metzger, F., Mischek, D., Stoffers, F. The Connected Steady State Model and the Interdependence of the CSF Proteome and CSF Flow Characteristics. Frontiers Neuroscience. 11, 241 (2017).
  14. Wolforth, J. Methods of blood collection in the mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  15. Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. Journal of Visualized Experiments. (21), e960 (2008).
  16. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  17. Johnston, S. A., Tobias, K. M. Veterinary Surgery: Small Animal Expert Consult – E-Book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
  18. Nigrovic, L. E., Shah, S. S., Neuman, M. I. Correction of cerebrospinal fluid protein for the presence of red blood cells in children with a traumatic lumbar puncture. Journal of Pediatrics. 159 (1), 158-159 (2011).
  19. McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler’s virus-induced demyelinating disease. Methods in Molecular Biology. 900, 381-401 (2012).
  20. Link, H., Tibbling, G. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. II. Relation of the concentration of the proteins in serum and cerebrospinal fluid. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 391-396 (1977).
  21. Tibbling, G., Link, H., Ohman, S. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. I. Establishment of reference values. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 385-390 (1977).
  22. Deisenhammer, F., et al. Guidelines on routine cerebrospinal fluid analysis. Report from an EFNS task force. European Journal of Neurology. 13 (9), 913-922 (2006).
  23. Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance. Methods in Molecular Biology. 686, 101-131 (2011).
  24. Zaias, J., Mineau, M., Cray, C., Yoon, D., Altman, N. H. Reference values for serum proteins of common laboratory rodent strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (4), 387-390 (2009).
  25. Felgenhauer, K., Renner, E. Hydrodynamic radii versus molecular weights in clearance studies of urine and cerebrospinal fluid. Annals of Clinical Biochemistry. 14 (2), 100-104 (1977).
  26. Pachner, A. R., DiSano, K., Royce, D. B., Gilli, F. Clinical utility of a molecular signature in inflammatory demyelinating disease. Neurology, Neuroimmunology & Neuroinflammation. 6 (1), 520 (2019).
  27. Pachner, A. R., Li, L., Gilli, F. Chemokine biomarkers in central nervous system tissue and cerebrospinal fluid in the Theiler’s virus model mirror those in multiple sclerosis. Cytokine. 76 (2), 577-580 (2015).
  28. Gerbi, C. Protein concentration in the arterial and venous renal blood serum of the rabbit. Archives of Biochemistry and Biophysics. 31 (1), 49-61 (1951).
  29. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  30. Reiber, H. Proteins in cerebrospinal fluid and blood: barriers, CSF flow rate and source-related dynamics. Restorative Neurology and Neuroscience. 21 (3-4), 79-96 (2003).
  31. Reiber, H. Knowledge-base for interpretation of cerebrospinal fluid data patterns. Essentials in neurology and psychiatry. Arquivos de Neuropsiquiatria. 74 (6), 501-512 (2016).
  32. Kuehne, L. K., Reiber, H., Bechter, K., Hagberg, L., Fuchs, D. Cerebrospinal fluid neopterin is brain-derived and not associated with blood-CSF barrier dysfunction in non-inflammatory affective and schizophrenic spectrum disorders. Journal of Psychiatric Research. 47 (10), 1417-1422 (2013).
  33. Bromader, S., et al. Changes in serum and cerebrospinal fluif cytokines in response to non-neurological surgery: an observational study. Journal of Neuroinflammation. 9, 242 (2012).
  34. Starhof, C., et al. Cerebrospinal fluid pro-inflammatory cytokines differentiate parkinsonian syndromes. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 305 (2018).

Play Video

Cite This Article
Gilli, F., Welsh, N. C., Linzey, M. R., Royce, D. B., DiSano, K. D., Pachner, A. R. Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice. J. Vis. Exp. (153), e60495, doi:10.3791/60495 (2019).

View Video