Verhoogde ruggenmergvloeistof eiwit niveaus kunnen ofwel het resultaat van diffusie van plasma eiwit over een veranderde bloed-hersen barrière of intrathecale synthese. Een geoptimaliseerd testprotocol wordt in dit artikel gepresenteerd dat helpt om beide gevallen te discrimineren en kwantitatieve metingen van intrathecaal gesynthetiseerde eiwitten verschaft.
Cerebrospinale vloeistof (CSF), een vloeistof gevonden in de hersenen en het ruggenmerg, is van groot belang voor zowel de basis-als de klinische wetenschap. De analyse van de CSF-eiwit samenstelling levert cruciale informatie in fundamenteel neurowetenschappelijk onderzoek en neurologische ziekten. Een voorbehoud is dat eiwitten gemeten in CSF kunnen voortvloeien uit intrathecale synthese en transudatie uit serum, en eiwitanalyse van CSF kan alleen de som van deze twee componenten bepalen. Om onderscheid te maken tussen eiwit transudatie uit het bloed en intrathecaal geproduceerde eiwitten in diermodellen en bij mensen, de metingen van het CSF-eiwit profiel met behulp van conventionele eiwitanalyse hulpmiddelen moeten de berekening omvatten van het albumine CSF/serum quotiënt (Q-albumine), een marker van de integriteit van de bloed-hersen interface (BBI) en de eiwit index (q-eiwit/q-albumine), een schatting van intrathecale eiwitsynthese. Dit protocol illustreert de gehele procedure, van CSF en bloedinzameling tot quotiënten en indices berekeningen, voor de kwantitatieve meting van intrathecale eiwitsynthese en de beperking van BBI in muismodellen van neurologische aandoeningen.
Cerebrospinale vloeistof (CSF), een heldere en kleurloze vloeistof rond de hersenen en het ruggenmerg, houdt grote klinische en fundamentele wetenschappelijke betekenis. De CSF behoudt de elektrolytische omgeving van het centrale zenuwstelsel (CNS), balanceert de systemische zuur-base status, levert voedingsstoffen aan neuronale en gliale cellen, functioneert als een lymfatisch systeem voor het CZS, en vervoert hormonen, neurotransmitters, cytokines en andere neuropeptiden in het CZS1. Dus, aangezien de CSF-samenstelling de activiteit van het CZS weerspiegelt, biedt deze vloeistof een waardevolle, hoewel indirecte, toegang om de fysiologische en pathologische toestand van het CZS te karakteriseren.
CSF is gebruikt voor de diagnose van aandoeningen die invloed hebben op het CNS voor meer dan honderd jaar, en voor de meeste van deze tijd, het werd voornamelijk bestudeerd door clinici als een diagnostisch instrument. In de afgelopen jaren hebben neuro biologen echter het potentieel van CSF erkend voor het bestuderen van de pathofysiologie van het CZS. In het bijzonder zijn er verschillende eiwitanalyse hulpmiddelen met hoge doorvoer geïntroduceerd in het neurowetenschaprijk, waardoor een gedetailleerde studie van de eiwit samenstelling van het CSF mogelijk is, met de verwachting dat deze analyse kan helpen om inzicht te geven in de dynamische veranderingen die zich binnen het CZS voordoen.
Technologische ontwikkelingen in multiplex immunoassay technieken zoals luminex en simoa Technologies2,3, bieden onderzoekers vandaag de mogelijkheid om honderden eiwitten te detecteren bij zeer lage concentraties. Bovendien maken deze zelfde technologieën het gebruik van kleine monsterhoeveelheden mogelijk, waardoor studies bij kleine dieren, waaronder muizen, worden bevorderd, waarbij beperkte monstervolumes van CSF tot voor kort de gedetailleerde kenmerken van de vloeistof hebben uitgesloten.
Niettemin is een voorbehoud dat eiwitten gemeten in CSF kunnen voortvloeien uit intrathecale synthese en/of transudatie uit het serum als gevolg van een beschadigde bloed-hersen interface (BBI). Helaas, eiwitanalyse van CSF alleen kan alleen de som van deze twee componenten te bepalen. Om onderscheid te maken tussen transudaat en intrathecaal geproduceerde eiwitten, moeten de CSF-eiwit metingen met behulp van een beschikbare proteïne-Analysetool worden aangepast voor individuele variabiliteit in serumconcentraties en barrière-integriteit. Hoewel deze aanpassing vaak wordt gebruikt in de klinische praktijk, bijvoorbeeld de CSF IgG-index, die een hoge gevoeligheid heeft voor het opsporen van intrathecale IgG-synthese4,5,6, hebben tot op heden zeer weinig onderzoeken de CSF-eiwit concentraties gecorrigeerd voor de serumconcentratie en barrière-integriteit7,8.
Momenteel is de Reibergram aanpak de beste manier om de barrièrefunctie en intrathecale synthese van eiwitten te bepalen. Het is een grafische evaluatie in CSF/serum quotiënt diagrammen die, op een geïntegreerde manier, zowel de barrière (dys) functie en intrathecale eiwitsynthese analyseert, verwijzend naar een uitsluitend bloed-afgeleid eiwit9,10. De zeer overvloedige eiwit albumine wordt meestal gekozen als referentie-eiwit omdat het alleen in de lever wordt geproduceerd en omdat de grootte, ongeveer 70 kDa, intermediair is tussen kleine en grote eiwitten11. Het analyseschema werd voor het eerst gedefinieerd door Reiber en Felgenhauer in 1987 voor de belangrijkste klassen van immunoglobulinen (IGS)11, empirisch gebaseerd op de resultaten verkregen uit de analyse van duizenden menselijke monsters9. De aanpak werd vervolgens bevestigd door de toepassing van de twee Fick-wetten van diffusie in de theorie van de Moleculaire diffusie/debiet12. Een dergelijke theorie toont aan dat de diffusie van een eiwit door de barrière een hyperbolische verdeling heeft en de dynamiek van eiwitten in het CZS9,13kwantificatief kan verklaren. Over het algemeen is het voordeel van het gebruik van het Reibergram voor het aantonen van intrathecale eiwitsynthese dat het gelijktijdig de eiwitfractie identificeert die de CSF uit het serum binnenkomt, evenals de hoeveelheid eiwit die in het CSF wordt aangetroffen vanwege lokale productie.
Het huidige artikel en het bijbehorende protocol beschrijven de hele procedure, van CSF en bloedafname tot de uiteindelijke berekeningen die de GSK-eiwit niveaus corrigeren, voor de kwantitatieve meting van intrathecale eiwitsynthese in muismodellen van neurologische Aandoeningen. Deze procedure vormt een basis voor de beoordeling (1) van de pathofysiologische oorsprong van elk CSF-eiwit en (2) de stabiliteit en de functionele betekenis van de barrière-integriteit. Deze procedure en het protocol zijn niet alleen nuttig voor het beoordelen van muis CSF-voorbeelden, maar zijn ook nuttig bij het analyseren van CSF in een veelheid van diermodellen van neurologische ziekten en menselijke patiënten.
Kwantitatieve methoden voor de evaluatie van verhoogde GSK-eiwit concentraties zijn nuttige hulpmiddelen bij de karakterisering van de fysiologische en pathologische toestand van het CZS. Afgezien van een betrouwbare kwantificering van het CSF-eiwitgehalte, vereist de opsporing van CSF-eiwitten echter een uitdrukking van de resultaten die discrimineert tussen in bloed en CNS afgeleide fracties in het CSF. Echter, tot nu toe, de veelgebruikte eiwit kwantificering assays niet toestaan discriminatie tussen de twee eiwit com…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken de medewerkers van het centrum voor vergelijkende geneeskunde en onderzoek (CCMR) bij Dartmouth voor hun deskundige verzorging van de muizen die voor deze studies werden gebruikt. Het onderzoeksfonds Bornstein financierde dit onderzoek.
1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
1 mL syringe | BD | 329622 | |
25 gauge needle | BD | 305122 | |
3 mL syringe | BD | 309582 | |
30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
Absorbent pads | Any suitable brand | ||
Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
Ethanol | Kopter | V1001 | |
Freezer | VWR | VWR32086A | |
Gauze | Medline | NON25212 | |
Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
Induction Chamber | VETEQUIP | ||
Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt – 1 mm |
Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
Polyethylene tubing | |||
Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
Scale | Uline | H2716 | |
Scalpel | Feather | EF7281 | |
Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |