マウスにおけるインテコール内合成タンパク質の定量測定
Summary
高い脊髄液タンパク質レベルは、変化した血液脳関門または細胞内合成を横切る血漿タンパク質の拡散の結果であり得る。この記事では、両方のケースを判別するのに役立ち、インテコール内合成タンパク質の定量的測定を提供する最適化されたテストプロトコルを紹介します。
Abstract
脳と脊髄に見られる液体である脳脊髄液(CSF)は、基礎科学と臨床科学の両方にとって非常に重要です。CSFタンパク質組成物の分析は、基本的な神経科学研究や神経疾患において重要な情報を提供します。1つの注意点は、CSFで測定されたタンパク質は、血清からの細胞内合成とトランスダクションの両方から得られ得ることであり、CSFのタンパク質分析は、これら2つの成分の合計のみを決定することができるということです。動物モデルおよびヒトにおける血液およびインテカリー産生タンパク質からのタンパク質のトランスレーションを区別するには、従来のタンパク質解析ツールを用いたCSFタンパク質プロファイリング測定には、アルブミンCSF/血清商法(Qアルブミン)、血液脳界面の完全性のマーカー(BBI)、およびタンパク質指数(Qタンパク質/Qアルブミン)の計算を含める必要があります。このプロトコルは、CSFおよび血液採取から商および指標計算まで、神経障害のマウスモデルにおける細胞内タンパク質合成およびBBI障害の定量的測定のための手順全体を示す。
Introduction
脳と脊髄を取り巻く透明で無色の液体である脳脊髄液(CSF)は、臨床的かつ基本的な科学的重要性を有する。CSFは、中枢神経系(CNS)の電解環境を維持し、全身酸基在状態のバランスをとり、神経細胞およびグリア細胞に栄養を供給し、CNSのリンパ系として機能し、CNS1全体でホルモン、神経伝達物質、サイトカインおよび他の神経ペプチドを輸送する。したがって、CSF組成物はCNSの活性を反映するように、この流体は、CNSの生理学的および病理学的状態を特徴付けるために、間接的であるが、貴重なアクセスを提供する。
CSFは100年以上にわたりCNSに影響を与える状態を診断するために使用されており、この時間のほとんどは、主に診断ツールとして臨床医によって研究されました。しかしながら、近年、神経生物学者は、CNSの病態生理学を研究するためのCSFの可能性を認識している。特に、神経科学分野では、CSFのタンパク質組成の詳細な研究を可能にするいくつかのハイスループットタンパク質解析ツールが導入されており、この解析が動的変化に関する洞察を提供する可能性があることを期待しています。CNS 内で発生します。
ルミネックスやシモア技術2、3などの多重免疫測定技術の技術開発は、今日、研究者に非常に低濃度で何百ものタンパク質を検出する能力を提供します。さらに、これらの同じ技術は、小さなサンプル量の使用を可能にし、それによって、CSFの限られたサンプル量が最近まで流体の詳細な特徴を排除しているマウスを含む小動物の研究を促進する。
それにもかかわらず、CSFで測定されたタンパク質は、血液脳界面(BBI)の損傷による血清からの細胞内合成および/またはトランスデュースに由来する可能性が1つの注意点である。残念ながら、CSF単独のタンパク質分析は、これら2つの成分の合計のみを決定することができます。トランスデートとインテカリー生産タンパク質を区別するには、利用可能なタンパク質分析ツールを使用したCSFタンパク質測定は、血清濃度およびバリア完全性の個々の変動性に合わせて調整する必要があります。しかしながら、この調整は臨床現場で一般的に用いられているが、例えば、心内IgG合成を検出する感度が高いCSF IgG指数4、5、6、血清濃度およびバリア完全性に対するCSFタンパク質濃度を補正した研究はこれまでにほとんどない。
現在、ライバーグラムアプローチは、タンパク質のバリア機能と内体合成を決定する最良の方法です。これは、排他的に血液由来タンパク質9、10を指す、組み込み方法で、バリア(dys)機能と細胞内タンパク質合成の両方を分析するCSF/血清商量図におけるグラフィカル評価である。非常に豊富なタンパク質アルブミンは、通常、肝臓でのみ産生され、その大きさは約70kDaが小さいタンパク質と大きなタンパク質11の間の中間であるため、通常参照タンパク質として選択される。分析図は、1987年にライバーとフェルゲンハウアーによって最初に定義された免疫グロブリン(Igs)11の主要なクラスについて、何千ものヒトサンプル9の分析から得られた結果に基づいて経験的に示されている。このアプローチは、その後、分子拡散/流量12の理論における拡散の2つのフィックの法則の適用によって確認された。このような理論は、バリアを介したタンパク質の拡散が双曲線分布を有し、CNS9、13におけるタンパク質のダイナミクスを定量的に説明できることを示す。全体的に、皮内タンパク質合成を実証するためにライバーグラムを使用する利点は、血清からCSFに入るタンパク質画分と、局所生産のためにCSFに見られるタンパク質の量を同時に同定することである。
本稿及び関連プロトコルは、CSF及び血液採取からCSFタンパク質レベルを補正する最終計算まで、神経学的マウスモデルにおける細胞内タンパク質合成の定量的測定のための手順全体を記述する。障害。この手順は、(1)任意のCSFタンパク質の病態生理学的起源および(2)バリア完全性の安定性および機能的意義を評価するためのベースラインを提供する。この手順とプロトコルは、マウスCSFサンプルを評価するのに有用であるだけでなく、神経疾患およびヒト患者の多数の動物モデルにおけるCSFの分析にも有用である。
Protocol
Representative Results
Discussion
増加したCSFタンパク質濃度の評価のための定量的方法は、CNSの生理学的および病理学的状態の特徴付けに有用なツールである。しかし、CSFタンパク質レベルの信頼性の高い定量を超えて、CSFタンパク質の検出には、CSFにおける血液およびCNS由来画分を区別する結果の発現が必要です。しかし、現在までに、一般的に使用されるタンパク質定量アッセイは、ハイスループットツールの助けを借?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ダートマスの比較医学研究センター(CCMR)のスタッフに、これらの研究に使用されるマウスの専門的なケアに感謝する。ボルンスタイン研究基金は、この研究に資金を提供しました。
Materials
| 1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
| 1 mL syringe | BD | 329622 | |
| 25 gauge needle | BD | 305122 | |
| 3 mL syringe | BD | 309582 | |
| 30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
| Absorbent pads | Any suitable brand | ||
| Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
| BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
| BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
| BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
| Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
| Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
| Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
| Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
| Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
| Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
| Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
| Ethanol | Kopter | V1001 | |
| Freezer | VWR | VWR32086A | |
| Gauze | Medline | NON25212 | |
| Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
| Induction Chamber | VETEQUIP | ||
| Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
| Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
| MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
| Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
| Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt – 1 mm |
| Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
| MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
| Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
| Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
| Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
| Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
| PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
| PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
| Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
| Polyethylene tubing | |||
| Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
| Scale | Uline | H2716 | |
| Scalpel | Feather | EF7281 | |
| Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
| Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
| Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
| Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
| Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
| Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
| Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
| Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |
References
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