Medición cuantitativa de proteínas sintetizadas intratecalmente en ratones
Summary
Los niveles elevados de proteína de líquido cefalorraquídeo pueden ser el resultado de la difusión de proteína plasmática a través de una barrera hematoencefálica alterada o de la síntesis intratecal. En este artículo se presenta un protocolo de prueba optimizado que ayuda a discriminar ambos casos y proporciona mediciones cuantitativas de proteínas sintetizadas intratecalmente.
Abstract
El líquido cefalorraquídeo (LCR), un líquido que se encuentra en el cerebro y la médula espinal, es de gran importancia para la ciencia básica y clínica. El análisis de la composición de proteínas del LIF proporciona información crucial en la investigación básica de neurociencia, así como en enfermedades neurológicas. Una advertencia es que las proteínas medidas en el LSC pueden derivar tanto de la síntesis intratecal como de la transudación del suero, y el análisis proteico del LSC sólo puede determinar la suma de estos dos componentes. Para discriminar entre la transudación de proteínas de la sangre y las proteínas producidas intratecalmente en modelos animales, así como en humanos, las mediciones de perfilado de proteínas CSF utilizando herramientas convencionales de análisis de proteínas deben incluir el cálculo del cociente cSF/suero de albúmina (Qalbúmina),un marcador de la integridad de la interfaz hematoencefálico (BBI) y el índice de proteínas(proteínaQ /Qalbumin),una estimación de la síntesis de proteínas intralacales. Este protocolo ilustra todo el procedimiento, desde el LCM y la recolección de sangre hasta los cálculos de cocientes e índices, para la medición cuantitativa de la síntesis de proteínas intratecales y el deterioro de la BBI en modelos de ratón de trastornos neurológicos.
Introduction
El líquido cefalorraquídeo (LCR), un líquido transparente e incoloro que rodea el cerebro y la médula espinal, tiene una gran importancia clínica y científica básica. El LSN preserva el entorno electrolítico del sistema nervioso central (SNC), equilibra el estado sistémico de la base de ácidos, suministra nutrientes a las células neuronales y gliales, funciona como un sistema linfático para el SNC, y transporta hormonas, neurotransmisores, citoquinas y otros neuropéptidos a lo largo del SNC1. Así, como la composición del LSNC refleja la actividad del SNC, este fluido ofrece un valioso, aunque indirecto, acceso para caracterizar el estado fisiológico y patológico del SNC.
El LSN se ha utilizado para diagnosticar afecciones que afectan al SNC durante más de cien años, y durante la mayor parte de este tiempo, fue estudiado principalmente por los médicos como una herramienta de diagnóstico. Sin embargo, en los últimos años los neurobiólogos han reconocido el potencial del LIF para estudiar la fisiopatología del SNC. En particular, se han introducido varias herramientas de análisis de proteínas de alto rendimiento en el ámbito de la neurociencia, lo que permite un estudio detallado de la composición proteica del LSCA, con la expectativa de que este análisis puede ayudar a proporcionar información sobre los cambios dinámicos que ocurre dentro del SNC.
Los desarrollos tecnológicos en técnicas de inmunoensayo multiplex como Luminex y Simoa technologies2,3, proporcionan a los investigadores hoy en día la capacidad de detectar cientos de proteínas a concentraciones muy bajas. Además, estas mismas tecnologías permiten el uso de pequeños volúmenes de muestra, promoviendo así estudios en animales pequeños, incluidos ratones, en los que volúmenes de muestras limitados de LIF han impedido caracterizaciones detalladas del fluido hasta hace poco.
Sin embargo, una advertencia es que las proteínas medidas en el LCC pueden derivar de la síntesis intratecal y/o la transudación del suero debido a una interfaz hematoencefálica (BBI) dañada. Desafortunadamente, el análisis proteico del LIF por sí solo sólo puede determinar la suma de estos dos componentes. Para discriminar entre las proteínas transsufechadas y producidas intratecalmente, las mediciones de proteínas CSF que utilicen cualquier herramienta de análisis de proteínas disponible deben ajustarse para la variabilidad individual en las concentraciones séricas, así como para la integridad de la barrera. Sin embargo, aunque este ajuste se utiliza comúnmente en la práctica clínica, por ejemplo, el índice IgG de La CSF, que tiene alta sensibilidad para detectar la síntesis intratecal de IgG4,5,6, hasta la fecha muy pocos estudios de investigación han corregido las concentraciones de proteína CSF para la concentración sérica y la integridad de la barrera7,8.
Actualmente, el enfoque Reibergram es la mejor manera de determinar la función de barrera y la síntesis intratecal de proteínas. Se trata de una evaluación gráfica en diagramas de cocientes CSF/suero que analiza, de forma integrada, tanto la función de barrera (dys) como la síntesis de proteínas intratecales, refiriéndose a una proteína exclusivamente derivada de la sangre9,10. La albúmina proteica muy abundante suele ser elegida como proteína de referencia porque se produce sólo en el hígado y porque su tamaño, de aproximadamente 70 kDa, es intermedio entre proteínas pequeñas y grandes11. El diagrama de análisis fue definido por primera vez por Reiber y Felgenhauer en 1987 para las principales clases de inmunoglobulinas (Igs)11,siendo empíricamente basado en los resultados obtenidos del análisis de miles de muestras humanas9. El enfoque fue confirmado posteriormente por la aplicación de las dos leyes de difusión de Fick en la teoría de la difusión molecular/velocidad de flujo12. Tal teoría demuestra la difusión de una proteína a través de la barrera tiene una distribución hiperbólica y puede explicar cuantitativamente la dinámica de las proteínas en el SNC9,13. En general, la ventaja de utilizar el Reibergram para demostrar la síntesis de proteínas intratecales es que identifica simultáneamente la fracción proteica que entra en el LRESULT desde el suero, así como la cantidad de proteína que se encuentra en el LIF debido a la producción local.
El presente artículo y el protocolo relacionado describen todo el procedimiento, desde el LC y la recolección de sangre hasta los cálculos finales que corrigen los niveles de proteína CSF, para la medición cuantitativa de la síntesis de proteínas intratecales en modelos de ratón de Trastornos. Este procedimiento proporciona una línea de base para evaluar (1) el origen fisiopatológico de cualquier proteína del LCP y (2) la estabilidad y la importancia funcional de la integridad de la barrera. Este procedimiento y protocolo no sólo son útiles para evaluar muestras de CSF de ratón, sino que también son útiles en el análisis de la CSF en una multitud de modelos animales de enfermedades neurológicas y pacientes humanos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos cuantitativos para la evaluación del aumento de las concentraciones de proteínas del LSC son herramientas útiles en la caracterización del estado fisiológico y patológico del SNC. Sin embargo, más allá de la cuantificación fiable de los niveles de proteína sofo, la detección de proteínas del LIF requiere una expresión de resultados que discriminen entre las fracciones derivadas de la sangre y del SNC en el LRESULT. Sin embargo, hasta la fecha, los ensayos de cuantificación de proteínas comúnm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al personal del Centro de Medicina Comparada e Investigación (CCMR) de Dartmouth por su cuidado experto de los ratones utilizados para estos estudios. El Fondo de Investigación Bornstein financió esta investigación.
Materials
| 1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
| 1 mL syringe | BD | 329622 | |
| 25 gauge needle | BD | 305122 | |
| 3 mL syringe | BD | 309582 | |
| 30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
| Absorbent pads | Any suitable brand | ||
| Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
| BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
| BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
| BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
| Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
| Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
| Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
| Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
| Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
| Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
| Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
| Ethanol | Kopter | V1001 | |
| Freezer | VWR | VWR32086A | |
| Gauze | Medline | NON25212 | |
| Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
| Induction Chamber | VETEQUIP | ||
| Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
| Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
| MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
| Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
| Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt – 1 mm |
| Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
| MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
| Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
| Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
| Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
| Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
| PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
| PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
| Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
| Polyethylene tubing | |||
| Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
| Scale | Uline | H2716 | |
| Scalpel | Feather | EF7281 | |
| Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
| Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
| Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
| Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
| Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
| Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
| Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
| Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |
References
- Whedon, J. M., Glassey, D. Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance. Alternative Therapies in Health and Medicine. 15 (3), 54-60 (2009).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer’s disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
- Barro, C., et al. Fluid biomarker and electrophysiological outcome measures for progressive MS trials. Multiple Sclerosis. 23 (12), 1600-1613 (2017).
- Tourtellotte, W. W., et al. Multiple sclerosis: measurement and validation of central nervous system IgG synthesis rate. Neurology. 30 (3), 240-244 (1980).
- Bonnan, M. Intrathecal IgG synthesis: a resistant and valuable target for future multiple sclerosis treatments. Multiple Sclerosis International. 2015, 296184 (2015).
- Reiber, H. Cerebrospinal fluid–physiology, analysis and interpretation of protein patterns for diagnosis of neurological diseases. Multiple Sclerosis. 4 (3), 99-107 (1998).
- DiSano, K. D., Linzey, M. R., Royce, D. B., Pachner, A. R., Gilli, F. Differential neuro-immune patterns in two clinically relevant murine models of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 109 (2019).
- Pachner, A. R., Li, L., Lagunoff, D. Plasma cells in the central nervous system in the Theiler’s virus model of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 232 (1-2), 35-40 (2011).
- Reiber, H. Flow rate of cerebrospinal fluid (CSF)–a concept common to normal blood-CSF barrier function and to dysfunction in neurological diseases. Journal of Neurological Sciences. 122 (2), 189-203 (1994).
- Reiber, H., Zeman, D., Kusnierova, P., Mundwiler, E., Bernasconi, L. Diagnostic relevance of free light chains in cerebrospinal fluid – The hyperbolic reference range for reliable data interpretation in quotient diagrams. Clinica Chimica Acta. 497, 153-162 (2019).
- Reiber, H., Felgenhauer, K. Protein transfer at the blood cerebrospinal fluid barrier and the quantitation of the humoral immune response within the central nervous system. Clinica Chimica Acta. 163 (3), 319-328 (1987).
- Dorta-Contreras, A. J. Reibergrams: essential element in cerebrospinal fluid immunological analysis. Revista de Neurologia. 28 (10), 996-998 (1999).
- Metzger, F., Mischek, D., Stoffers, F. The Connected Steady State Model and the Interdependence of the CSF Proteome and CSF Flow Characteristics. Frontiers Neuroscience. 11, 241 (2017).
- Wolforth, J. Methods of blood collection in the mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. Journal of Visualized Experiments. (21), e960 (2008).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
- Johnston, S. A., Tobias, K. M. Veterinary Surgery: Small Animal Expert Consult – E-Book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Nigrovic, L. E., Shah, S. S., Neuman, M. I. Correction of cerebrospinal fluid protein for the presence of red blood cells in children with a traumatic lumbar puncture. Journal of Pediatrics. 159 (1), 158-159 (2011).
- McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler’s virus-induced demyelinating disease. Methods in Molecular Biology. 900, 381-401 (2012).
- Link, H., Tibbling, G. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. II. Relation of the concentration of the proteins in serum and cerebrospinal fluid. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 391-396 (1977).
- Tibbling, G., Link, H., Ohman, S. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. I. Establishment of reference values. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 385-390 (1977).
- Deisenhammer, F., et al. Guidelines on routine cerebrospinal fluid analysis. Report from an EFNS task force. European Journal of Neurology. 13 (9), 913-922 (2006).
- Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance. Methods in Molecular Biology. 686, 101-131 (2011).
- Zaias, J., Mineau, M., Cray, C., Yoon, D., Altman, N. H. Reference values for serum proteins of common laboratory rodent strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (4), 387-390 (2009).
- Felgenhauer, K., Renner, E. Hydrodynamic radii versus molecular weights in clearance studies of urine and cerebrospinal fluid. Annals of Clinical Biochemistry. 14 (2), 100-104 (1977).
- Pachner, A. R., DiSano, K., Royce, D. B., Gilli, F. Clinical utility of a molecular signature in inflammatory demyelinating disease. Neurology, Neuroimmunology & Neuroinflammation. 6 (1), 520 (2019).
- Pachner, A. R., Li, L., Gilli, F. Chemokine biomarkers in central nervous system tissue and cerebrospinal fluid in the Theiler’s virus model mirror those in multiple sclerosis. Cytokine. 76 (2), 577-580 (2015).
- Gerbi, C. Protein concentration in the arterial and venous renal blood serum of the rabbit. Archives of Biochemistry and Biophysics. 31 (1), 49-61 (1951).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Reiber, H. Proteins in cerebrospinal fluid and blood: barriers, CSF flow rate and source-related dynamics. Restorative Neurology and Neuroscience. 21 (3-4), 79-96 (2003).
- Reiber, H. Knowledge-base for interpretation of cerebrospinal fluid data patterns. Essentials in neurology and psychiatry. Arquivos de Neuropsiquiatria. 74 (6), 501-512 (2016).
- Kuehne, L. K., Reiber, H., Bechter, K., Hagberg, L., Fuchs, D. Cerebrospinal fluid neopterin is brain-derived and not associated with blood-CSF barrier dysfunction in non-inflammatory affective and schizophrenic spectrum disorders. Journal of Psychiatric Research. 47 (10), 1417-1422 (2013).
- Bromader, S., et al. Changes in serum and cerebrospinal fluif cytokines in response to non-neurological surgery: an observational study. Journal of Neuroinflammation. 9, 242 (2012).
- Starhof, C., et al. Cerebrospinal fluid pro-inflammatory cytokines differentiate parkinsonian syndromes. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 305 (2018).
