القياس الكمي للبروتينات التركيبية داخل الفئران
Summary
يمكن ان تكون مستويات بروتين السائل الشوكي مرتفعه اما نتيجة لانتشار بروتين البلازما عبر حاجز الدم في الدماغ المتغيرة أو توليف داخل البراز. يتم تقديم بروتوكول الاختبار الأمثل في هذه المقالة التي تساعد علي التمييز بين الحالتين ويوفر قياسات كميه من البروتينات توليفها داخل المركبة.
Abstract
السائل النخاعي (السائل الدماغي الشوكي) ، وهو السوائل الموجودة في الدماغ والحبل الشوكي ، له اهميه كبيره للعلوم الاساسيه والسريرية علي حد سواء. تحليل تكوين بروتين السائل الدماغي الشوكي يوفر معلومات حاسمه في البحوث الاساسيه لعلوم الأعصاب وكذلك الامراض العصبية. ويتمثل أحد التحذيرات في ان البروتينات المقيسة في السائل الدماغي الشوكي قد تستمد من كل من التوليف داخل البراز والاستخلاص من المصل ، وان تحليل البروتين في السائل الدماغي الشوكي لا يمكن الا ان يحدد مجموع هذين المكونين. ان يميز بين [ترنسسوايشن] بروتين من الدم وينتج [اينترثيكلي] بروتينات في نماذج حيوانيه [اس ول س] في أناس, يجب ان تشمل قياسات البروتين السائل الدماغي الشوكي باستخدام أدوات تحليل البروتين التقليدية حساب الزلال السائل الدماغي الشوكي/مصل الدم (سالزلال) ، وهو علامة علي سلامه واجهه الدماغ (ابي) ، ومؤشر البروتين (سبروتين/سالزلال) ، وهو تقدير لتخليق البروتين داخل البراز. يوضح هذا البروتوكول الاجراء بأكمله ، من السائل الدماغي الشوكي وجمع الدم إلى حسابات الحواصل والمؤشرات ، للقياس الكمي لتخليق البروتين داخل البراز وضعف الكلي في نماذج الفئران من الاضطرابات العصبية.
Introduction
السائل الدماغي الشوكي ، وهو سائل واضح وعديم اللون المحيطة الدماغ والحبل النخاعي ، يحمل اهميه كبيره السريرية والعلمية الاساسيه. وهكذا ، وبما ان تكوين السائل الدماغي الشوكي يعكس نشاط النفثالينات العصبية المركزية ، فان هذا السائل يوفر وصولا قيما ، وان كان غير مباشر ، لتوصيف الحالة الفسيولوجية والمرضية للجهاز العصبي المركزي.
وقد استخدم السائل الدماغي الشوكي لتشخيص الحالات التي تؤثر علي النفثالينات العصبي المركزي لأكثر من مائه سنه ، وفي معظم الوقت ، تمت دراسته في المقام الأول من قبل الأطباء كاداه تشخيصيه. ومع ذلك ، في السنوات الاخيره وقد اعترف علماء البيولوجيا العصبية إمكانات السائل الدماغي الشوكي لدراسة الفيزيولوجيا المرضية للجهاز العصبي المركزي. وعلي وجه الخصوص ، تم إدخال العديد من أدوات تحليل البروتين عاليه الانتاجيه في مجال علوم الأعصاب مما يسمح باجراء دراسة مفصله لتكوين البروتين في السائل الدماغي الشوكي ، مع توقع ان هذا التحليل قد يساعد في توفير نظره ثاقبه علي التغيرات الديناميكية التي تحدث داخل النفثالينات العصبية.
التطورات التكنولوجية في تقنيات الفحص متعددة المناعة مثل لومينكس وتقنيات سيموا 2،3، تزودالباحثيناليوم بالقدرة علي اكتشاف المئات من البروتينات بتركيزات منخفضه جدا. وعلاوة علي ذلك ، تسمح هذه التكنولوجيات نفسها باستخدام كميات صغيره من العينات ، مما يشجع علي اجراء دراسات في الكائنات الصغيرة ، بما في ذلك الفئران ، التي حالت فيها احجام العينات المحدودة من السائل الدماغي الشوكي دون التوصيف المفصل للسائل حتى وقت قريب.
ومع ذلك ، فان أحد التحذيرات هو ان البروتينات المقيسة في السائل الدماغي الشوكي قد تستمد من التوليف داخل البراز و/أو من المصل بسبب وجود واجهه تالفة في الدم والدماغ (آيبي). لسوء الحظ ، تحليل البروتين من السائل الدماغي الشوكي وحده لا يمكن الا ان يحدد مجموع هذين العنصرين. للتمييز بين البروتينات المنتجة والبروتينية داخل الدم ، يجب تعديل قياسات بروتين السائل الدماغي الشوكي باستخدام اي أداه تحليل البروتين المتاحة للتغير الفردي في تركيزات المصل وكذلك سلامه الحاجز. ومع ذلك ، علي الرغم من ان هذا التعديل يستخدم عاده في الممارسة السريرية ، علي سبيل المثال ، مؤشر السائل الدماغي الشوكي ، الذي لديه حساسية عاليه للكشف عن التوليف داخل البراز4،5،6، حتى الآن الدراسات البحثية قليله جدا تصحيح تركيزات بروتينالسائل النخاعي لتركيزالمصل
وفي الوقت الراهن ، فان نهج ريبرغرام هو أفضل طريقه لتحديد وظيفة الحاجز وتوليف البروتينات داخل البراز. وهو تقييم رسومي في مخططات السائل الدماغي الشوكي/المصل الذي يحلل ، بطريقه متكاملة ، كل من وظيفة الحاجز (dys) وتخليق البروتين داخل البراز ، في اشاره إلى بروتين مشتق من الدم حصرا9،10. وعاده ما يتم اختيار الزلال البروتين وفيرة للغاية كمرجع البروتين لأنه يتم إنتاجه فقط في الكبد ولان حجمه ، تقريبا 70 كده ، هو وسيط بين البروتينات الصغيرة والكبيرة11. تم تعريف الرسم التخطيطي التحليل لأول مره من قبل رييبر وفينشهاور في 1987 للفئات الرئيسية من الغلوبولين المناعي (Igs)11, يجري تجريبيا استنادا إلى النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل آلاف من العينات البشرية9. وقد تاكد هذا النهج في وقت لاحق من خلال تطبيق قوانين Fick الخاصة بالنشر في نظرية الانتشار الجزيئي/معدل التدفق12. مثل هذه النظرية يدل علي انتشار البروتين من خلال الحاجز لديه توزيع القطعي ويمكن ان تفسر كميا ديناميات البروتينات في الCNS9,13. وعموما ، فان ميزه استخدام ريبرجرام لإظهار تخليق البروتين داخل البراز هو انه يحدد في نفس الوقت كسر البروتين الذي يدخل السائل الدماغي الشوكي من المصل وكذلك كميه البروتين الموجودة في السائل الدماغي الشوكي بسبب الإنتاج المحلي.
تصف هذه المادة والبروتوكول المتعلق بها الاجراء بأكمله ، من السائل الدماغي الشوكي وجمع الدم إلى الحسابات النهائية لتصحيح مستويات بروتين السائل النخاعي ، للقياس الكمي لتخليق البروتين داخل البراز في نماذج الفئران من العصبية اضطرابات. ويوفر هذا الاجراء أساسا لتقييم (1) الأصل الباثولوجي لأي بروتين سائل نخاعي و (2) الاستقرار والاهميه الوظيفية لسلامه الحاجز. هذا الاجراء والبروتوكول ليست مفيده فقط لتقييم عينات الماوس السائل الدماغي الشوكي ولكنها مفيده أيضا في تحليل السائل الدماغي الشوكي في العديد من النماذج الحيوانية من الامراض العصبية والمرضي البشريين.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطرق الكمية لتقييم زيادة تركيزات البروتين السائل الدماغي الشوكي هي أدوات مفيده في توصيف الحالة الفسيولوجية والمرضية للجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك ، وبعد التحديد الكمي الموثوقه لمستويات بروتين السائل النخاعي ، يتطلب الكشف عن بروتينات السائل الدماغي الشوكي التعبير عن النتائج التي تميز…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفون موظفي مركز الطب المقارن والبحوث (CCMR) في دارتموث علي رعايتهم الخبيرة للفئران المستخدمة في هذه الدراسات. ومول صندوق بحوث بورنشتاين هذا البحث.
Materials
| 1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
| 1 mL syringe | BD | 329622 | |
| 25 gauge needle | BD | 305122 | |
| 3 mL syringe | BD | 309582 | |
| 30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
| Absorbent pads | Any suitable brand | ||
| Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
| BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
| BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
| BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
| Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
| Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
| Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
| Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
| Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
| Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
| Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
| Ethanol | Kopter | V1001 | |
| Freezer | VWR | VWR32086A | |
| Gauze | Medline | NON25212 | |
| Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
| Induction Chamber | VETEQUIP | ||
| Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
| Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
| MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
| Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
| Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt – 1 mm |
| Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
| MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
| Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
| Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
| Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
| Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
| PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
| PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
| Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
| Polyethylene tubing | |||
| Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
| Scale | Uline | H2716 | |
| Scalpel | Feather | EF7281 | |
| Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
| Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
| Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
| Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
| Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
| Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
| Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
| Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |
References
- Whedon, J. M., Glassey, D. Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance. Alternative Therapies in Health and Medicine. 15 (3), 54-60 (2009).
- Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer’s disease. Methods. 56 (4), 484-493 (2012).
- Barro, C., et al. Fluid biomarker and electrophysiological outcome measures for progressive MS trials. Multiple Sclerosis. 23 (12), 1600-1613 (2017).
- Tourtellotte, W. W., et al. Multiple sclerosis: measurement and validation of central nervous system IgG synthesis rate. Neurology. 30 (3), 240-244 (1980).
- Bonnan, M. Intrathecal IgG synthesis: a resistant and valuable target for future multiple sclerosis treatments. Multiple Sclerosis International. 2015, 296184 (2015).
- Reiber, H. Cerebrospinal fluid–physiology, analysis and interpretation of protein patterns for diagnosis of neurological diseases. Multiple Sclerosis. 4 (3), 99-107 (1998).
- DiSano, K. D., Linzey, M. R., Royce, D. B., Pachner, A. R., Gilli, F. Differential neuro-immune patterns in two clinically relevant murine models of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 109 (2019).
- Pachner, A. R., Li, L., Lagunoff, D. Plasma cells in the central nervous system in the Theiler’s virus model of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 232 (1-2), 35-40 (2011).
- Reiber, H. Flow rate of cerebrospinal fluid (CSF)–a concept common to normal blood-CSF barrier function and to dysfunction in neurological diseases. Journal of Neurological Sciences. 122 (2), 189-203 (1994).
- Reiber, H., Zeman, D., Kusnierova, P., Mundwiler, E., Bernasconi, L. Diagnostic relevance of free light chains in cerebrospinal fluid – The hyperbolic reference range for reliable data interpretation in quotient diagrams. Clinica Chimica Acta. 497, 153-162 (2019).
- Reiber, H., Felgenhauer, K. Protein transfer at the blood cerebrospinal fluid barrier and the quantitation of the humoral immune response within the central nervous system. Clinica Chimica Acta. 163 (3), 319-328 (1987).
- Dorta-Contreras, A. J. Reibergrams: essential element in cerebrospinal fluid immunological analysis. Revista de Neurologia. 28 (10), 996-998 (1999).
- Metzger, F., Mischek, D., Stoffers, F. The Connected Steady State Model and the Interdependence of the CSF Proteome and CSF Flow Characteristics. Frontiers Neuroscience. 11, 241 (2017).
- Wolforth, J. Methods of blood collection in the mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. Journal of Visualized Experiments. (21), e960 (2008).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
- Johnston, S. A., Tobias, K. M. Veterinary Surgery: Small Animal Expert Consult – E-Book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
- Nigrovic, L. E., Shah, S. S., Neuman, M. I. Correction of cerebrospinal fluid protein for the presence of red blood cells in children with a traumatic lumbar puncture. Journal of Pediatrics. 159 (1), 158-159 (2011).
- McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler’s virus-induced demyelinating disease. Methods in Molecular Biology. 900, 381-401 (2012).
- Link, H., Tibbling, G. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. II. Relation of the concentration of the proteins in serum and cerebrospinal fluid. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 391-396 (1977).
- Tibbling, G., Link, H., Ohman, S. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. I. Establishment of reference values. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37 (5), 385-390 (1977).
- Deisenhammer, F., et al. Guidelines on routine cerebrospinal fluid analysis. Report from an EFNS task force. European Journal of Neurology. 13 (9), 913-922 (2006).
- Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance. Methods in Molecular Biology. 686, 101-131 (2011).
- Zaias, J., Mineau, M., Cray, C., Yoon, D., Altman, N. H. Reference values for serum proteins of common laboratory rodent strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (4), 387-390 (2009).
- Felgenhauer, K., Renner, E. Hydrodynamic radii versus molecular weights in clearance studies of urine and cerebrospinal fluid. Annals of Clinical Biochemistry. 14 (2), 100-104 (1977).
- Pachner, A. R., DiSano, K., Royce, D. B., Gilli, F. Clinical utility of a molecular signature in inflammatory demyelinating disease. Neurology, Neuroimmunology & Neuroinflammation. 6 (1), 520 (2019).
- Pachner, A. R., Li, L., Gilli, F. Chemokine biomarkers in central nervous system tissue and cerebrospinal fluid in the Theiler’s virus model mirror those in multiple sclerosis. Cytokine. 76 (2), 577-580 (2015).
- Gerbi, C. Protein concentration in the arterial and venous renal blood serum of the rabbit. Archives of Biochemistry and Biophysics. 31 (1), 49-61 (1951).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Reiber, H. Proteins in cerebrospinal fluid and blood: barriers, CSF flow rate and source-related dynamics. Restorative Neurology and Neuroscience. 21 (3-4), 79-96 (2003).
- Reiber, H. Knowledge-base for interpretation of cerebrospinal fluid data patterns. Essentials in neurology and psychiatry. Arquivos de Neuropsiquiatria. 74 (6), 501-512 (2016).
- Kuehne, L. K., Reiber, H., Bechter, K., Hagberg, L., Fuchs, D. Cerebrospinal fluid neopterin is brain-derived and not associated with blood-CSF barrier dysfunction in non-inflammatory affective and schizophrenic spectrum disorders. Journal of Psychiatric Research. 47 (10), 1417-1422 (2013).
- Bromader, S., et al. Changes in serum and cerebrospinal fluif cytokines in response to non-neurological surgery: an observational study. Journal of Neuroinflammation. 9, 242 (2012).
- Starhof, C., et al. Cerebrospinal fluid pro-inflammatory cytokines differentiate parkinsonian syndromes. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 305 (2018).
