Mesure quantitative des protéines synthétisées intrathéquement chez les souris
Summary
Les niveaux élevés de protéine de fluide spinal peuvent être le résultat de la diffusion de la protéine de plasma à travers une barrière hémato-encéphalique altérée ou la synthèse intrathécale. Un protocole d’essai optimisé est présenté dans cet article qui aide à discriminer les deux cas et fournit des mesures quantitatives des protéines synthétisées intrathécally.
Abstract
Le liquide céphalo-rachidien (CSF), un fluide trouvé dans le cerveau et la moelle épinière, est d’une grande importance pour la science fondamentale et clinique. L’analyse de la composition des protéines du FSC fournit des informations cruciales dans la recherche fondamentale en neurosciences ainsi que dans les maladies neurologiques. Une mise en garde est que les protéines mesurées dans CSF peuvent dériver de la synthèse intrathécale et la transudation du sérum, et l’analyse des protéines de CSF ne peut déterminer la somme de ces deux composants. Pour faire la distinction entre la transudation des protéines dans le sang et les protéines produites par voie intrathéque dans les modèles animaux ainsi que chez les humains, les mesures de profilage des protéines CSF à l’aide d’outils conventionnels d’analyse des protéines doivent inclure le calcul du quotient d’albumine CSF/sérum (Qalbumin), un marqueur de l’intégrité de l’interface sang-cerveau (BBI), et l’indice protéique (Qprotein/Qalbumin), une estimation de la synthèse intrathécale. Ce protocole illustre l’ensemble de la procédure, du CSF et de la collecte de sang aux quotients et aux calculs d’indices, pour la mesure quantitative de la synthèse intrathécale de protéine et de l’affaiblissement de BBI dans des modèles de souris des désordres neurologiques.
Introduction
Le liquide céphalo-rachidien (CSF), un liquide clair et incolore entourant le cerveau et la moelle épinière, détient une grande importance clinique et scientifique fondamentale. Le CSF préserve l’environnement électrolytique du système nerveux central (SNC), équilibre le statut systémique acide-base, fournit des nutriments aux cellules neuronales et gliales, fonctionne comme un système lymphatique pour le SNC, et transporte des hormones, neurotransmetteurs, cytokines et autres neuropeptides tout au long du SNC1. Ainsi, comme la composition du CSF reflète l’activité du SNC, ce fluide offre un accès précieux, bien qu’indirect, pour caractériser l’état physiologique et pathologique du SNC.
CSF a été utilisé pour diagnostiquer les conditions qui affectent le SNC depuis plus de cent ans, et pour la plupart de ce temps, il a été principalement étudié par les cliniciens comme un outil de diagnostic. Cependant, au cours des dernières années, les neurobiologistes ont reconnu le potentiel de la FSC pour l’étude de la physiopathologie du SNC. En particulier, plusieurs outils d’analyse des protéines à haut débit ont été introduits dans le domaine des neurosciences, ce qui a permis une étude détaillée de la composition des protéines du CSF, dans l’espoir que cette analyse pourrait aider à mieux comprendre les changements dynamiques. se produisent au sein du SNC.
Les développements technologiques dans les techniques d’immuno-analyse multiplex telles que Luminex et Simoa technologies2,3, fournissent aux chercheurs d’aujourd’hui la capacité de détecter des centaines de protéines à de très faibles concentrations. En outre, ces mêmes technologies permettent l’utilisation de petits volumes d’échantillons, favorisant ainsi des études chez les petits animaux, y compris les souris, dans lesquelles des volumes d’échantillons limités de CSF ont empêché des caractérisations détaillées du fluide jusqu’à récemment.
Néanmoins, une mise en garde est que les protéines mesurées dans CSF peuvent dériver de la synthèse intrathécale et / ou la transudation du sérum en raison d’une interface sang-cerveau endommagée (BBI). Malheureusement, l’analyse des protéines de CSF seul ne peut déterminer la somme de ces deux composants. Pour faire la distinction entre les protéines transudées et les protéines produites par voie intrathéque, les mesures des protéines CSF à l’aide de tout outil d’analyse des protéines disponible doit être ajustée en fonction de la variabilité individuelle des concentrations de sérum ainsi que de l’intégrité de la barrière. Cependant, bien que cet ajustement soit couramment utilisé dans la pratique clinique, par exemple, l’indice IgG de CSF, qui a la sensibilité élevée pour détecter la synthèse intrathécale d’IgG4,5,6, à ce jour très peu d’études de recherche ont corrigé des concentrations de protéine de CSF pour la concentration de sérum et l’intégrité de barrière7,8.
Actuellement, l’approche Reibergram est le meilleur moyen de déterminer la fonction de barrière et la synthèse intrathécale des protéines. Il s’agit d’une évaluation graphique dans les diagrammes du quotient cSF/sérum qui analyse, de manière intégrée, à la fois la fonction barrière (dys) et la synthèse des protéines intrathécales, se référant à une protéine exclusivement dérivée du sang9,10. L’albumine protéique très abondante est généralement choisie comme protéine de référence parce qu’elle est produite seulement dans le foie et parce que sa taille, approximativement 70 kDa, est intermédiaire entre les petites et grandes protéines11. Le diagramme d’analyse a été défini pour la première fois par Reiber et Felgenhauer en 1987 pour les principales classes d’immunoglobulines (Igs)11, étant empiriquement basé sur les résultats obtenus à partir de l’analyse de milliers d’échantillons humains9. L’approche a ensuite été confirmée par l’application des deux lois de diffusion de Fick dans la théorie de la diffusion moléculaire/taux de débit12. Une telle théorie démontre la diffusion d’une protéine à travers la barrière a une distribution hyperbolique et peut expliquer quantitativement la dynamique des protéines dans le SNC9,13. Dans l’ensemble, l’avantage d’utiliser le Reibergram pour démontrer la synthèse des protéines intrathécales est qu’il identifie simultanément la fraction de protéines qui pénètre dans le CSF à partir du sérum ainsi que la quantité de protéines trouvées dans le CSF en raison de la production locale.
Le présent article et le protocole connexe décrivent l’ensemble de la procédure, du CSF et de la collecte de sang aux calculs finaux corrigeant les niveaux de protéine de CSF, pour la mesure quantitative de la synthèse intrathécale de protéine dans les modèles de souris de neurologique Troubles. Cette procédure fournit une ligne de base contre laquelle évaluer (1) l’origine pathophysiologique de toute protéine de CSF et (2) la stabilité et la signification fonctionnelle de l’intégrité de barrière. Cette procédure et ce protocole sont non seulement utiles pour évaluer les échantillons de CSF de souris, mais sont également utiles dans l’analyse de CSF dans une multitude de modèles animaux des maladies neurologiques et des patients humains.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les méthodes quantitatives pour l’évaluation des concentrations accrues de protéines De CSF sont des outils utiles dans la caractérisation de l’état physiologique et pathologique du SNC. Cependant, au-delà de la quantification fiable des niveaux de protéines CSF, la détection des protéines CSF nécessite une expression de résultats qui discrimine entre les fractions dérivées du sang et du SNC dans le CSF. Cependant, à ce jour, les tests de quantification des protéines couramment utilisés ne permettent pas …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le personnel du Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) de Dartmouth pour les soins qu’ils ont soignés aux souris utilisées pour ces études. Le Fonds de recherche De Bornstein a financé cette recherche.
Materials
| 1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
| 1 mL syringe | BD | 329622 | |
| 25 gauge needle | BD | 305122 | |
| 3 mL syringe | BD | 309582 | |
| 30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
| Absorbent pads | Any suitable brand | ||
| Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
| BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
| BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
| BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
| Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
| Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
| Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
| Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
| Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
| Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
| Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
| Ethanol | Kopter | V1001 | |
| Freezer | VWR | VWR32086A | |
| Gauze | Medline | NON25212 | |
| Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
| Induction Chamber | VETEQUIP | ||
| Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
| Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
| MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
| Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
| Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt – 1 mm |
| Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
| MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
| Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
| Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
| Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
| Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
| Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
| PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
| PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
| Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
| Polyethylene tubing | |||
| Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
| Scale | Uline | H2716 | |
| Scalpel | Feather | EF7281 | |
| Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
| Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
| Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
| Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
| Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
| Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
| Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
| Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
| Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
| Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |
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