En kvantitativ Fluorescens mikroskopi-baseret enkelt Liposome-analyse til påvisning af den kompositoriske Inhomogenitet mellem individuelle Liposomer
Summary
Denne protokol beskriver fremstillingen af Liposomer, og hvordan disse kan være immobiliseret på en overflade og afbildet individuelt i en massiv parallel måde ved hjælp af Fluorescens mikroskopi. Dette giver mulighed for kvantificering af størrelsen og kompositoriske inhomogenitet mellem enkelte Liposomer af befolkningen.
Abstract
De fleste forskning, der beskæftiger Liposomer som membran modelsystemer eller narkotika levering bærere er afhængig af bulk læse-out teknikker og dermed iboende antager alle Liposomer af ensemblet at være identiske. Nye eksperimentelle platforme, der kan observere Liposomer på enkelt partikel niveau, har imidlertid gjort det muligt at udføre meget sofistikerede og kvantitative undersøgelser af protein-membran interaktioner eller lægemiddel bæreegenskaber på individuelle Liposomer, således undgår fejl fra ensemble gennemsnit. Her præsenterer vi en protokol til forberedelse, påvisning og analyse af enkelte Liposomer ved hjælp af en fluorescens baseret mikroskopi analyse, der letter sådanne enkelt partikel målinger. Opsætningen giver mulighed for billeddannelse individuelle Liposomer i en massiv parallel måde og er ansat til at afsløre intra-stikprøvestørrelse og kompositoriske inhomogeniteter. Desuden, protokollen beskriver fordelene ved at studere Liposomer på det enkelte Liposom niveau, begrænsningerne af analysen, og de vigtige funktioner, der skal overvejes, når de ændrer det til at studere andre forskningsspørgsmål.
Introduction
Liposomer er sfæriske phospholipid-baserede vesikler, der er stærkt anvendt både i grundlæggende og anvendt forskning. De fungerer som fremragende membran modelsystemer, fordi deres fysisk-kemiske egenskaber let kan manipuleres ved at variere de lipid komponenter, der udgør Liposom1,2. Også, Liposomer udgør den mest anvendte Drug levering nanocarrier system, tilbyder forbedret farmakokinetik og farmakodynamik samt høj biokompatibilitet3.
I mange år, Liposomer er primært blevet undersøgt ved hjælp af bulk-teknikker, giver kun adgang til ensemble gennemsnitlige læse-out værdier. Dette har ført hovedparten af disse undersøgelser til at antage, at alle Liposomer i ensemblet er identiske. Sådanne ensemble-gennemsnitlige værdier er dog kun korrekte, hvis det underliggende datasæt er jævnt fordelt omkring middelværdien, men kan repræsentere en falsk og forudindtaget konklusion, hvis datasættet omfatter flere uafhængige populationer, f. eks. Derudover, forudsat at ensemble betyder at repræsentere hele befolkningen kan overse de oplysninger, der harkede sig i inhomogeniteten mellem Liposomer. Først for nylig har der vist sig kvantitative analyser, som er i stand til at sonde enkelte Liposomer, afslører store inhomogeniteter mellem individuelle Liposomer med hensyn til vigtige fysisk-kemiske egenskaber, herunder Liposom størrelse4, lipid sammensætning5,6, og indkapsling effektivitet7, fremhæver betydningen af at studere Liposomer på det enkelte Liposom niveau.
Et forskningsområde, hvor ensemble gennemsnit af Liposom egenskaber har vist sig at bias resultater er at studere Liposom størrelse-afhængige protein-membran interaktioner8,9. Traditionelt, forskere, der studerer sådanne processer har været begrænset til at forberede Liposomer med forskellige ensemble gennemsnitlige diametre ved ekstrudering gennem filtre med forskellige porestørrelser9. Men, udtrække diameteren af individuelle Liposomer ved hjælp af enkelt Liposom assays har afsløret store befolknings overlap, med Liposomer ekstruderet ved hjælp af 100 nm og 200 Nm filtre viser op til 70% overlap i deres størrelse fordeling4. Dette kunne alvorligt bias bulk målinger af Liposom størrelse-afhængige protein-membran interaktioner10. Udførelse af membran-protein interaktion undersøgelser ved hjælp af enkelt Liposom assay, forskerne i stedet benyttede sig af størrelsen-polydispersitet i prøven, giver dem mulighed for at studere en bred vifte af Liposom diametre inden for hvert enkelt eksperiment, lette nye opdagelser af hvordan membran krumning og sammensætning kan påvirke protein rekruttering til membraner4,11,12. Et andet område, hvor anvendelsen af enkelt Liposom assays har vist sig instrumental er i Mekanistiske undersøgelser af protein-medieret membran fusion13,14. For sådanne kinetiske målinger linderede evnen til at studere individuelle fusions hændelser behovet for en eksperimentel synkronisering af fusionsprocessen, hvilket gav mulighed for ny mekanistisk indsigt, som ellers ville være gået tabt i den spatiotemporale gennemsnit udført i bulk ensemble målinger. Desuden er enkelt Liposomer blevet brugt som en membran stilladser, der gør det muligt at måle individuelle proteiner og tilbyde ny viden om transmembran protein strukturel dynamik15,16. Desuden gjorde sådanne proteoliposome-baserede opsætninger det muligt at studere funktionen af individuelle transmembran transportører17 og pore dannende protein komplekser18 samt mekanismen af bioaktive membran-permeabilizing peptider19. Enkelt Liposomer er også blevet brugt som bløde stof nanofluidics med overflade-immobiliseret enkelt Liposomer tjener som kamre til enzymatiske reaktioner i mængder på 10-19 L, øge gennemløb og kompleksiteten af screening assays med minimalt produkt forbrug20.
For nylig, enkelt Liposom assays har været brugt til at karakterisere Drug levering Liposomer på et tidligere forældet niveau af detaljer. Forskerne var i stand til at kvantificere væsentlige inhomogeniteter i mængden af polymer fastgjort til overfladen af individuelle Liposomer21. Den enkelte Liposom assays også tilladt målinger af Drug levering Liposomer i komplekse medier, såsom blodplasma, afslørende hvordan elementer forankret til liposomoverfladen gennem lipid ankre kan være modtagelige for dissociation når Liposomer er udsat for betingelser efterligne dem, der opleves under in vivo cirkulation22. Samlet set er alsidigheden og nytten af de enkelte Liposom assays underbygget af de mange forskellige problemer, som disse opsætninger har været ansat til at løse, og vi forestiller mig, at metodologien fortsat vil blive udviklet og finde anvendelse på nye videnskabelige områder.
Her beskriver vi en fluorescens Microscopy-baseret enkelt Liposom-analyse, der tillader individuelle Liposomer at blive undersøgt i en høj gennemløb måde (figur 1). For at illustrere metoden bruger vi den til at kvantificere størrelsen og den kompositoriske inhomogenitet mellem individuelle Liposomer i et ensemble. Analysen anvender fluorescens mikroskop billeder af enkelt Liposomer immobiliseret på en passiveret glasoverflade. Vi beskriver først de kritiske trin i Liposom fabrikationsprocessen, der sikrer korrekt fluorescerende Liposom mærkning og immobilisering. Derefter beskriver vi den overflade forberedelse, der er nødvendig for at lette Liposom immobilisering, før den skitserer proceduren for at sikre passende Liposom overflade tæthed. Vi diskuterer mikroskopi parametre vigtigt for at erhverve høj kvalitet billeder og afgrænse, hvordan man udfører simple dataanalyse, tillader udvinding af Liposom størrelse og kompositoriske inhomogenitet. Denne generiske protokol bør give den interesserede forsker et godt grundlag for at udvikle analysen yderligere for hans eller hendes specifikke forskningsinteresse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er vigtigt at bemærke, at mens vi beskriver i detaljer, hvordan den enkelte Liposomer assay kan bruges til at studere kompositoriske inhomogenitet mellem individuelle Liposomer, platformen er meget alsidig. Som tidligere vist og diskuteret i indledningen, kan protokollen let tilpasses til at studere aspekter af membran-membran fusion, protein-membran interaktioner, eller liposomal Drug Carrier karakterisering. For alle videnskabelige spørgsmål, der behandles, kraften i den enkelte Liposom assay ligger i evnen til …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af det danske råd for uafhængig forskning [tilskudsnummer 5054-00165B].
Materials
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65C | ||
| Heating plate w. Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
References
- Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).
- Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).
- Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
- Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
- Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).
- Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
- Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
- Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
- Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are “Selected” upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
- Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
- Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
- Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
- Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
- Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).
- Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
- Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
- Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
- Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
