Bireysel Lipozomlar Arasındaki Bileşimsel Homojenliği Saptamak için Kantitatif Floresan Mikroskopesi Bazlı Tek Lipozom Testi
Summary
Bu protokol lipozomların imalatını ve bunların bir yüzeyüzerinde nasıl hareketsiz hale getirilebildiğini ve floresan mikroskopi kullanılarak büyük bir paralel şekilde tek tek nasıl görüntülenebileceğini açıklar. Bu, popülasyonun tek lipozomları arasındaki boyutun ve bileşimsel homojenliğin nicelikselleştirilmesine olanak sağlar.
Abstract
Membran model sistemleri veya ilaç dağıtım taşıyıcıları olarak lipozomların çoğunun toplu okuma tekniklerine dayandığını ve böylece özünde topluluğun tüm lipozomlarının aynı olduğunu varsayar. Ancak, tek parçacık düzeyinde lipozomları gözlemleyebilen yeni deneysel platformlar, bireysel lipozomlarda protein-membran etkileşimleri veya ilaç taşıyıcı özellikleri üzerinde son derece gelişmiş ve kantitatif çalışmalar yapılmasını mümkün kılabilir, böylece topluluk ortalama gelen hataları kaçınarak. Burada floresan bazlı mikroskopi testini kullanarak tek lipozomların hazırlanması, saptandırılmasını ve analiz ini sağlayan ve bu tür tek parçacık ölçümlerini kolaylaştıran bir protokol sıyoruz. Kurulum büyük bir paralel şekilde bireysel lipozomların görüntülenmesi için izin verir ve intra-örnek boyutu ve bileşimsel inhomojenlikleri ortaya çıkarmak için kullanılır. Ayrıca, protokol tek lipozom düzeyinde lipozomlar çalışma avantajları açıklar, test sınırlamaları, ve diğer araştırma soruları çalışmak için değiştirerek dikkat edilmesi gereken önemli özellikleri.
Introduction
Lipozomlar hem temel hem de uygulamalı araştırmalarda yoğun olarak kullanılan küresel fosfolipid bazlı veziküllerdir. Onlar mükemmel membran model sistemleri olarak işlev, onların fizyokimyasal özellikleri kolayca lipozom oluşturan lipid bileşenleri değiştirerek manipüle edilebilir çünkü1,2. Ayrıca, lipozomlar gelişmiş farmakokinetiği ve farmakodinamik yanı sıra yüksek biyouyumluluksunan,en çok kullanılan ilaç dağıtım nanocarrier sistemi oluşturmaktadır 3 .
Uzun yıllar boyunca, lipozomlar öncelikle toplu teknikler kullanılarak incelenmiştir, sadece topluluk ortalama okuma değerlerine erişim veren. Bu topluluk taki tüm lipozomlar aynı olduğunu varsaymak için bu çalışmaların çoğunluğu yol açmıştır. Ancak, bu tür topluluk ortalaması değerleri yalnızca temel veri kümesi ortalama değer etrafında eşit olarak dağıtılırsa doğrudur, ancak veri kümesi örneğin birden çok bağımsız popülasyon içeriyorsa yanlış ve önyargılı bir sonucu temsil edebilir. Ayrıca, topluluk tüm nüfusu temsil etmek anlamına geldiğini varsayarak lipozomlar arasında inhomogeneity içinde barındırılan bilgileri göz ardı edebilirsiniz. Sadece son zamanlarda tek lipozomlar araştırmak mümkün kantitatif tahliller ortaya çıktı, lipozom boyutu da dahil olmak üzere önemli fizyochemical özellikleri ile ilgili bireysel lipozomlar arasında büyük inhomojeniteler ortaya ortaya çıktı4, lipid bileşimi5,6, ve kapsülleme verimliliği 7 , tek lipozom lar çalışma önemini vurgulayan7.
Lipozom özellikleri topluluk ortalama önyargı sonuçları gösterilmiştir bir araştırma alanı lipozom boyutuna bağlı protein-membranetkileşimleri8 ,9çalışıyor . Geleneksel olarak, bu tür süreçleri inceleyen araştırmacılar farklı gözenek boyutları9filtreler aracılığıyla ekstrüzyon tarafından farklı topluluk ortalama çapları ile lipozomlar hazırlanması için sınırlı olmuştur. Ancak, tek lipozom ların çapıtek lipozomların tek lipozom larının çıkarılması büyük popülasyon örtüşmelerini ortaya çıkarmıştır, lipozomlar 100 nm ve 200 nm filtreleri kullanarak ekstrüzyon ile% 70’e kadar kendi boyut dağılımı4çakışma gösteren . Bu ciddi lipozom boyutuna bağlı protein-membran etkileşimleri10toplu ölçümler önyargı olabilir. Tek lipozom testini kullanarak membran-protein etkileşim imasını gerçekleştiren araştırmacılar, bunun yerine numunenin içindeki boyut-polidispersitlikten yararlanarak, her bir deneyde çok çeşitli lipozom çaplarını incelemelerine olanak sağlayarak, membran eğriliği ve bileşiminin membranlara protein alımını nasıl etkileyebileceğine dair yeni keşifler kolaylaştırıyorlar4,11,12. Tek lipozom tahlilleri uygulama enstrümantal kanıtlamıştır başka bir alan protein aracılı membran füzyon mekanistik çalışmalarda13,14. Bu tür kinetik ölçümler için, bireysel füzyon olaylarını inceleme yeteneği, füzyon sürecinin deneysel senkronizasyonuna olan ihtiyacı hafifleterek, toplu topluluk ölçümlerinde yapılan spatiotemporal ortalamada kaybolacak yeni mekanistik anlayışlara olanak sağladı. Ayrıca, tek lipozomlar bir membran iskele olarak kullanılmıştır, bireysel proteinlerin ölçümü sağlayan ve transmembran protein yapısal dinamiği yeni bilgi sunan15,16. Ayrıca, bu tür proteolipozom tabanlı kurulumlar mümkün bireysel transmembran taşıyıcılar17 ve gözenek oluşturan protein kompleksleri18 fonksiyonu yanı sıra biyoaktif membran geçirimli peptidlermekanizmasının incelenmesi mümkün kı. Tek lipozomlar da 10-19 L hacimlerinde enzimatik reaksiyonlar için oda olarak hizmet veren yüzey immobilize tek lipozomlar ile yumuşak madde nanofluidics olarak kullanılmıştır, en az ürün tüketimi ile tarama tahlillerinin hacmi ve karmaşıklığını artırarak20.
Son zamanlarda, tek lipozom tahlilleri daha önce önceden haber verilmemiş bir ayrıntı düzeyinde ilaç dağıtım lipozomları karakterize etmek için kullanılmıştır. Araştırmacılar bireysel lipozomların yüzeyine bağlı polimer miktarı önemli inhomogeneities ölçmek başardık21. Tek lipozom tahlilleri de karmaşık ortamda ilaç teslim lipozomölçümleri izin, kan plazması gibi, lipozomlar ile lipozom lar aracılığıyla lipozom yüzeyine demirlemiş elemanların dissosiyasasyona duyarlı olabilir ortaya22. Genel olarak, tek lipozom tahlillerinin çok yönlülüğü ve kullanışlılığı, bu kurulumların ele alınması için kullanılan çok çeşitli sorunlarla kanıtlanmıştır ve metodolojinin geliştirilmeye ve yeni bilimsel alanlarda kullanılmaya devam edeceğini öngörüyoruz.
Burada, tek tek lipozomların yüksek iş lenme şeklinde incelenmesini sağlayan floresan mikroskopesi bazlı tek lipozom testini tanımlıyoruz (Şekil 1). Yöntemi göstermek için, bir topluluk içinde bireysel lipozomlar arasındaki boyut ve kompozisyon yamajenliğini ölçmek için kullanırız. Titre, pasif cam yüzeyüzerinde hareketsiz hale getirilen tek lipozomların floresan mikroskop görüntülemesini kullanır. Biz ilk uygun floresan lipozom etiketleme ve immobilizasyon sağlayan lipozom üretim sürecinde kritik adımları açıklar. Daha sonra, uygun lipozom yüzey yoğunluklarını sağlamak için prosedürü ana hatlarıyla özetlemeden önce lipozom immobilizasyonkolaylaştırmak için gerekli yüzey hazırlığı açıklar. Yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için önemli olan mikroskopi parametrelerini tartışıyoruz ve basit veri analizinin nasıl yapılacağını, lipozom boyutunun ve bileşimsel homojenliğin çıkarılmasına izin verilebildiğini anlatıyoruz. Bu genel protokol, ilgilenen araştırmacının kendi özel araştırma ilgi alanı için daha fazla araştırma yapmak için daha fazla araştırma yapması için iyi bir temel oluşturmalıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tek lipozom ların tek lipozomlar arasındaki bileşimsel homojenliği incelemek için nasıl kullanılabileceğini ayrıntılı olarak açıklarken, platformun çok yönlü olduğunu belirtmek önemlidir. Daha önce gösterildiği ve giriş tartışılan gibi, protokol kolayca membran-membran füzyon yönlerini incelemek için adapte edilebilir, protein-membran etkileşimleri, veya lipozomal ilaç taşıyıcı karakterizasyonu. Ele alınması gereken herhangi bir bilimsel soru için, tek lipozom test gücü topluluğun …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Danimarka Bağımsız Araştırma Konseyi tarafından finanse edilmiştir [hibe numarası 5054-00165B].
Materials
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65C | ||
| Heating plate w. Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
References
- Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).
- Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).
- Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
- Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
- Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).
- Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
- Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
- Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
- Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are “Selected” upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
- Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
- Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
- Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
- Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
- Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).
- Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
- Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
- Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
- Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
