Un ensayo de liposomio único basado en microscopía de fluorescencia cuantitativa para detectar la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales
Summary
Este protocolo describe la fabricación de liposomas y cómo estos pueden ser inmovilizados en una superficie e imágenes individualmente de una manera paralela masiva utilizando microscopía de fluorescencia. Esto permite la cuantificación del tamaño y la inhomogeneidad compositiva entre los liposomas individuales de la población.
Abstract
La mayoría de las investigaciones que emplean liposomas como sistemas de modelos de membrana o portadores de administración de fármacos se basa en técnicas de lectura a granel y por lo tanto intrínsecamente asume que todos los liposomas del conjunto son idénticos. Sin embargo, las nuevas plataformas experimentales capaces de observar liposomas a nivel de una sola partícula han hecho posible realizar estudios altamente sofisticados y cuantitativos sobre interacciones proteína-membrana o propiedades portadoras de fármacos en liposomas individuales, evitando así errores derivados del promedio del conjunto. Aquí presentamos un protocolo para preparar, detectar y analizar liposomas individuales mediante un ensayo de microscopía basado en fluorescencia, facilitando tales mediciones de una sola partícula. La configuración permite tomar imágenes de liposomas individuales de forma paralela masiva y se emplea para revelar el tamaño intramuestra y las inhomogeneidades compositivas. Además, el protocolo describe las ventajas de estudiar liposomas a nivel de liposomas individuales, las limitaciones del ensayo y las características importantes a tener en cuenta al modificarlo para estudiar otras preguntas de investigación.
Introduction
Los liposomas son vesículas esféricas a base de fosfolípidos que se utilizan en gran medida tanto en la investigación básica como en la aplicada. Funcionan como excelentes sistemas de modelos de membrana, ya que sus propiedades fisioquímicas se pueden manipular fácilmente variando los componentes lipídicos que componen el liposoma1,2. Además, los liposomas constituyen el sistema de nanoportadores de administración de fármacos más utilizado, ofreciendo una mejor farmacocinética y farmacodinámica, así como una alta biocompatibilidad3.
Durante muchos años, los liposomas se han estudiado principalmente utilizando técnicas a granel, dando sólo acceso a los valores de lectura promedio del conjunto. Esto ha llevado a la mayoría de estos estudios a suponer que todos los liposomas en el conjunto son idénticos. Sin embargo, estos valores promediados por conjunto solo son correctos si el conjunto de datos subyacente se distribuye uniformemente alrededor del valor medio, pero puede representar una conclusión falsa y sesgada si el conjunto de datos incluye varias poblaciones independientes, por ejemplo. Además, suponiendo que el conjunto signifique representar a toda la población puede pasar por alto la información contenida dentro de la inhomogeneidad entre liposomas. Sólo recientemente han surgido ensayos cuantitativos que son capaces de sondear liposomas individuales, revelando grandes inhomogeneidades entre liposomas individuales con respecto a propiedades fisicoquímicas importantes incluyendo liposomas tamaño4, composición de lípidos5,6,y encapsulación eficiencia7, destacando la importancia de estudiar liposomas en el nivel de liposomas individuales.
Un área de investigación donde el promediado de conjunto de propiedades de liposomas se ha demostrado para sesgar los resultados está estudiando las interacciones proteína-membrana dependientes del tamaño de liposomas8,9. Tradicionalmente, los investigadores que estudian estos procesos se han limitado a la preparación de liposomas con diferentes diámetros medios de conjunto por extrusión a través de filtros con diferentes tamaños de poros 9. Sin embargo, la extracción del diámetro de los liposomas individuales utilizando ensayos de liposomas individuales ha revelado grandes solapamientos de población, con liposomas extruidos utilizando filtros de 100 nm y 200 nm que muestran hasta un 70% de superposición en su distribución de tamaño4. Esto podría sesgar severamente las mediciones a granel de las interacciones proteína-membrana dependientes del tamaño liposoma10. Realizando los estudios de interacción membrana-proteína utilizando el ensayo de un solo liposomas, los investigadores en su lugar aprovecharon el tamaño-polidispersidad dentro de la muestra, lo que les permite estudiar una amplia gama de diámetros de liposoma dentro de cada experimento individual, facilitando nuevos descubrimientos de cómo la curvatura de la membrana y la composición pueden afectar el reclutamiento de proteínas a las membranas4,11,12. Otro campo donde la aplicación de ensayos de un solo liposoma ha demostrado ser instrumental es en estudios mecánicos de fusión de membrana mediada por proteínas13,14. Para tales mediciones cinéticas, la capacidad de estudiar eventos de fusión individuales alivió la necesidad de la sincronización experimental del proceso de fusión, permitiendo nuevas perspectivas mecanicistas que de otro modo se habrían perdido en el promedio espaciotemporal realizado en mediciones de conjuntos a granel. Además, se han utilizado liposomas individuales como andamio de membrana, permitiendo la medición de proteínas individuales y ofreciendo nuevos conocimientos sobre la dinámica estructural de proteínas transmembranas15,16. Además, tales configuraciones basadas en proteoliposomas hicieron posible estudiar la función de los transportadores transmembranas individuales17 y los complejos proteicos formados poros18, así como el mecanismo de los péptidos bioactivos permeabilizadores de membrana19. Los liposomas individuales también se han utilizado como nanofluídicos de materia blanda con liposomas individuales inmovilizados en superficie que sirven como cámaras para reacciones enzimáticas en volúmenes de 10-19 L, aumentando el rendimiento y la complejidad de los ensayos de cribado con un consumo mínimo de producto20.
Recientemente, ensayos de liposomas individuales se han utilizado para caracterizar liposomas de administración de medicamentos en un nivel de detalle previamente sin pre-enpreenented. Los investigadores fueron capaces de cuantificar inhomogeneidades significativas en la cantidad de polímero unido a la superficie de liposomas individuales21. Los ensayos de un solo liposomas también permitieron mediciones de liposomas de administración de fármacos en medios complejos, como plasma sanguíneo, revelando cómo los elementos anclados a la superficie liposoma a través de anclajes lipídicos pueden ser susceptibles a la disociación cuando los liposomas están expuestos a condiciones que imitan a los experimentados durante la circulación in vivo22. En general, la versatilidad y utilidad de los ensayos de un solo liposo se corroboran por la gran variedad de problemas que estas configuraciones se han empleado para abordar, y imaginamos que la metodología continuará desarrollándose y encontrando uso en nuevos campos científicos.
Aquí describimos un ensayo de liposomas único basado en microscopía de fluorescencia que permite estudiar liposomas individuales de una manera de alto rendimiento(Figura 1). Para ilustrar el método, lo usamos para cuantificar el tamaño y la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales dentro de un conjunto. El ensayo emplea imágenes de microscopio de fluorescencia de liposomas individuales inmovilizados en una superficie de vidrio pasivado. Primero describimos los pasos críticos en el proceso de fabricación de liposomas que asegura el etiquetado y la inmovilización adecuados de liposomas fluorescentes. A continuación, describimos la preparación de la superficie necesaria para facilitar la inmovilización de liposomas antes de esbozar el procedimiento para asegurar densidades superficiales de liposomas adecuadas. Discutimos los parámetros de microscopía importantes para adquirir imágenes de alta calidad y delinear cómo realizar un análisis de datos simple, permitiendo la extracción de tamaño de liposomas e inhomogeneidad compositiva. Este protocolo genérico debe proporcionar una buena base para que el investigador interesado desarrolle el ensayo para su interés específico de investigación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es importante tener en cuenta que si bien describimos en detalle cómo el ensayo de liposomas individuales se puede utilizar para estudiar la inhomogeneidad compositiva entre liposomas individuales, la plataforma es muy versátil. Como se ha mostrado y discutido anteriormente en la introducción, el protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar aspectos de la fusión membrana-membrana, interacciones proteína-membrana o caracterización portadora de fármacos liposomal. Para cualquier pregunta científica que se a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Consejo Danés de Investigaciones Independientes [número de subvención 5054-00165B].
Materials
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65C | ||
| Heating plate w. Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
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