Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

A الكمي الفلورية المجهري القائم علي فحص ليبوسوم واحد للكشف عن التجانس التركيبي بين الجسيمات الشحمية الفردية

Published: December 13, 2019 doi: 10.3791/60538
Automatic Translation
1,3, 1,2,3, 1,2,3
1Center for Nanomedicine and Theranostics, Technical University of Denmark, 2Center for Intestinal Absorption and Transport of Biopharmaceuticals, Technical University of Denmark, 3Department of Health Technology, Technical University of Denmark

Summary

يصف هذا البروتوكول تلفيق الجسيمات الشحمية وكيف يمكن ان يتم تعبئتها علي سطح وبشكل فردي بطريقه متوازية ضخمه باستخدام المجهر الفلوري. وهذا يسمح للقياس الكمي للحجم والتجانس التركيبي بين الدهنيات واحد من السكان.

Abstract

معظم البحوث التي توظف الجسيمات الشحمية كما نظم نموذج الغشاء أو ناقلات تسليم المخدرات تعتمد علي تقنيات القراءة السائبة التالي يفترض في جوهرها جميع الشحمية من الفرقة لتكون متطابقة. ومع ذلك ، منصات تجريبية جديده قادره علي مراقبه الجسيمات الشحمية علي مستوي الجزيئات الواحدة جعلت من الممكن لاجراء دراسات عاليه التطور والكمية علي التفاعلات غشاء البروتين أو خصائص الناقل المخدرات علي الجسيمات الشحمية الفردية ، التالي تجنب الأخطاء من المتوسط الفرقة. هنا نقدم بروتوكولا لاعداد وكشف وتحليل الجسيمات الشحمية واحده باستخدام الفحص المجهري القائم علي الفلورية ، وتسهيل هذه القياسات أحاديه الجزيئات. الاعداد يسمح للتصوير الدهنية الفردية بطريقه موازيه ضخمه ويستخدم للكشف عن حجم داخل العينة والتركيبية المتجانسة. بالاضافه إلى ذلك ، يصف البروتوكول مزايا دراسة الجسيمات الشحمية في مستوي الشحمية الواحدة ، وحدود الفحص ، والميزات الهامه التي يجب مراعاتها عند تعديلها لدراسة الاسئله البحثية الأخرى.

Introduction

الدهنية هي الحويصلات القائمة علي فسفوليبيد كرويه التي تستخدم بشكل كبير علي حد سواء في البحوث الاساسيه والتطبيقية. انها تعمل كنظم ممتازة نموذج الغشاء ، لان خصائصها الفيزيائية يمكن التلاعب بها بسهوله عن طريق مختلف مكونات الدهون التي تشكل الشحمية1،2. أيضا ، الجسيمات الشحمية تشكل نظام nanocarrier تسليم المخدرات الأكثر استخداما ، وتقدم تحسين الدوائية و دوائي وكذلك التوافق البيولوجي عاليه3.

لسنوات عديده ، وقد درست الجسيمات الشحمية في المقام الأول باستخدام التقنيات السائبة ، وإعطاء فقط الوصول إلى الفرقة متوسط قيم القراءة المغادرة. وقد ادي هذا الغالبية من هذه الدراسات ان نفترض ان جميع الدهنية في الفرقة متطابقة. ومع ذلك ، فان هذه القيم المتوسطة للفرقة تكون صحيحه فقط إذا كانت مجموعه البيانات الاساسيه موزعه بشكل موحد حول القيمة المتوسطة ، ولكن يمكن ان تمثل استنتاجا زائفا ومتحيزا إذا كانت المجموعة تتضمن مجموعات سكانية مستقله متعددة ، علي سبيل المثال. بالاضافه إلى ذلك ، علي افتراض الفرقة يعني لتمثيل السكان بأكملها يمكن ان نغفل المعلومات بالضجر داخل التجانس بين الدهنية. فقط في الاونه الاخيره قد ظهرت المقايسات الكمية التي هي قادره علي التحقيق الشحمية واحده ، وكشف الجينات الكبيرة بين الدهنية الفردية فيما يتعلق بالخصائص الفيزيائية الكيميائية الهامه بما في ذلك حجم ليبوسوم4، وتكوين الدهون5،6، وكفاءه التغليف7، وتسليط

وقد أظهرت منطقه البحث حيث المتوسطة الفرقة من خصائص الشحمية لنتائج التحيز يدرس الدهنية حجم التفاعلات غشاء البروتين المعتمدة8,9. تقليديا ، تم تقييد الباحثين دراسة مثل هذه العمليات لاعداد الشحمية مع مختلف أقطار الفرقة المتوسطة عن طريق البثق من خلال الفلاتر مع احجام مختلفه المسام9. ومع ذلك ، استخراج قطر الجسيمات الشحمية الفردية باستخدام اختبارات الشحمية واحده وكشفت عن التداخلات السكانية الكبيرة ، مع الجسيمات الشحمية مقذوف باستخدام 100 nm و 200 nm مرشحات عرض ما يصل إلى 70 ٪ تراكب في توزيع حجمها4. وهذا يمكن ان التحيز بشده قياسات السائبة من التفاعلات الدهنية حجم البروتين المعتمدة علي الغشاء10. اجراء دراسات تفاعل البروتين الغشاء باستخدام الفحص الشحمي الواحد ، والباحثين بدلا من ذلك الاستفادة من حجم-المشتتة داخل العينة ، والسماح لهم لدراسة مجموعه واسعه من أقطار الشحمية داخل كل تجربه واحده ، وتسهيل الاكتشافات الجديدة لكيفيه انحناء الغشاء وتكوين يمكن ان تؤثر عليتجنيد البروتينإلى الاغشيه4 حقل آخر حيث تطبيق اختبارات الشحمية واحده أثبتت انها مفيده في الدراسات الميكانيكية من البروتين بوساطة غشاء الانصهار13,14. النسبة لهذه القياسات الحركية ، خففت القدرة علي دراسة احداث الانصهار الفردية من الحاجة إلى التزامن التجريبي لعمليه الانصهار ، مما سمح برؤى ميكانيكيه جديده لولا ذلك لفقدت في المتوسط المكاني الذي اجري في قياسات الفرقة السائبة. بالاضافه إلى ذلك, وقد استخدمت الجسيمات الشحمية واحد كسقالة غشاء, السماح لقياس البروتينات الفردية وتقديم المعرفة الجديدة علي ديناميات البروتين الغشاء المتحول15,16. وعلاوة علي ذلك ، فان هذه الاجهزه القائمة علي البروتينات البروتينية جعلت من الممكن دراسة وظيفة الناقلات الفردية عبر الغشاء17 ومجمعات البروتين التي تشكل المسام18 وكذلك اليه الغشاء النشط بيولوجيا-الذي يتخلل الببتيدات19. وقد استخدمت الجسيمات الشحمية واحد أيضا نانوفلويديكس المواد اللينة مع الجسيمات الشحمية السطحية التي تعمل كغرف لردود الفعل الانزيميه في احجام من 10إلى 19 لتر ، وزيادة الانتاجيه وتعقيد اختبارات الفرز مع استهلاك المنتج الحد الأدنى20.

في الاونه الاخيره ، وقد استخدمت اختبارات الشحمية واحده لتوصيف الجسيمات الشحمية تسليم المخدرات في مستوي لم يسبق له سابقا من التفاصيل. وكان الباحثون قادرين علي تحديد كميات كبيره من التجانس في كميه البوليمر تعلق علي سطح الجسيمات الشحمية21. وسمحت اختبارات الشحمية الواحدة أيضا قياسات الدهنيات تسليم المخدرات في وسائل الاعلام المعقدة ، مثل بلازما الدم ، والكشف عن كيفيه العناصر الراسية إلى سطح الشحمية من خلال المراسي الدهون يمكن ان تكون عرضه للانفصام عندما تتعرض الشحمية للظروف محاكاة تلك التي شهدت خلالالدورةالمجري وبشكل عام ، فان براعة وفائدة اختبارات الشحمية الواحدة مدعمه بمجموعه كبيره من المشاكل التي استخدمت هذه الاجهزه لمعالجتها ، ونحن نتصور ان المنهجية ستستمر في التطوير والبحث عن الاستخدام في المجالات العلمية الجديدة.

هنا نقوم بوصف الفحص المجهري القائم علي المجهر الأحادي الذي يسمح بدراسة الدهنيات الفردية بطريقه عاليه الانتاجيه (الشكل 1). لتوضيح هذه الطريقة ، ونحن نستخدمها لقياس حجم والتجانس التركيبي بين الجسيمات الشحمية داخل الفرقة. الفحص يستخدم التصوير المجهر مضان من الجسيمات الشحمية الوحيدة التي تم تعبئتها علي سطح زجاجي تخليته. ونحن أولا وصف الخطوات الحاسمة في عمليه تصنيع الشحمية التي تضمن السليمة الفلورسنت التسمية الدهنية والتجميد. ثم ، ونحن وصف الاعداد السطحية اللازمة لتسهيل الشفط الشحمي قبل تحديد الاجراء لضمان كثافة سطح الدهنية المناسبة. نناقش المعلمات المجهرية الهامه للحصول علي صور عاليه الجودة وتحديد كيفيه اجراء تحليل البيانات البسيطة ، والسماح لاستخراج حجم الشحمية والتجانس التركيبي. وينبغي لهذا البروتوكول العام ان يوفر أساسا جيدا للباحث المهتم بالأمر لكي يطور الفحص أكثر لفائدته البحثية المحددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. اعداد الليليسوم

ملاحظه: لفتره وجيزة ، واعداد الشحمية عاده ما يتضمن ثلاث خطوات حاسمه: 1) اعداد الأفلام الدهنية الجافة من تكوين الدهون المطلوب ؛ 2) الاماهه من الدهون لتشكيل الشحمية. و 3) السيطرة علي حجم و lamellarity من السكان الدهنية.

  1. تزن الدهون وتذوب في tert-butanol: المياه (9:1) في قوارير زجاجيه.
    1. حل POPC (1-بالميتويل-اوليريل-غليثيرو-3-فوسفولكولين ؛ ميغاواط = 760 جرام/مول) إلى 50 مم.
    2. تذوب الكولسترول (MW = 387 g/mol) إلى 25 ملم.
    3. أذابه المخدرات-Atto488 (1 ، 2-دياولييل-sn-غليسرو-3-فوسفونوثانولامين-Atto488 ؛ ميغاواط = 1,316 جرام/مول) إلى 0.1 مم.
    4. أذابه المخدرات-Atto655 (1 ، 2-دياولييل-sn-غليسرو-3-فوسفونوثانولامين-Atto655 ؛ ميغاواط = 1,368 جرام/مول) إلى 0.1 مم.
    5. أذابه PEG2000-البيوتين (1 ، 2-ديتريل-sn-غليجليرو-3-فوسفاتيثانولامين-N-[بيونوريل (البولي إيثيلين غليكول)-2000] ؛ ميغاواط = 3,017 جرام/مول) إلى 0.1 مم.
      ملاحظه: الدهون الحرارة إلى 55 درجه مئوية واستخدام التحريك المغناطيسي من أجل ضمان حل كامل للدهون. بدلا من ذلك ، استخدم حمام سونيكيشن. يمكن تخزين مخزونات الدهون غير المستخدمة عند-20 درجه مئوية لعده أشهر.
  2. مزيج الدهون المخزونات التي أعدت في الخطوة 1.1 إلى نسبه المولي من POPC: الكوليسترول: Atto488: منشطات-Atto655: منشطات-PEG-البيوتين 68.95:30:0.5:0.5:0.05 ، عن طريق أضافه 138 μL من POPC ، 120 μL من الكولسترول ، 500 μL من كل فلوريسسينتلي المسمي الدهون ، و 50 μL من دبي-بيج-البيوتين إلى قارورة زجاجيه جديده.
    ملاحظه: يمكن بسهوله تعديل تكوين الشحمية بالبالضبط من أجل معالجه مساله محدده من الفائدة. راجع المناقشة للحصول علي مزيد من التفاصيل.
  3. تخفيف غطاء القارورة الزجاجية ، والمفاجئة تجميد القارورة في النيتروجين السائل.
  4. تجفيف خليط الدهون المجمدة بين عشيه وضحيها.
  5. أضافه 1 مل من 200 mM العازلة D-السوربيتول (العازلة السوربيتول) إلى الدهون الجافة.
  6. يسخن الخليط إلى 45 درجه مئوية ويعرض لتحريك مغناطيسي لمده 1 ساعة علي الأقل.
    ملاحظه: يجب ان يعكس المخزن المؤقت السؤال المحدد الذي يتم معالجته (علي سبيل المثال ، الظروف الفسيولوجية لدراسة تفاعلات البروتين الغشاء ، أو العازلة المعتمدة سريريا محدده لدراسة الدهنيات تسليم المخدرات). ومع ذلك ، إذا لم يكن مطلوبا المخزن مؤقت محدده للدراسة ، يمكن تطبيق المخزن مؤقت بدون أيونات للاماهه من أجل الحد من تعدد الدهون الشحمية.
  7. تجميد تعليق الدهون عن طريق غمس القارورة في النيتروجين السائل ، والانتظار حتى يتم تجميد التعليق تماما.
  8. تراجع تعليق المجمدة في حمام التدفئة في 55 درجه مئوية حتى يذوب الخليط تماما.
  9. كرر الخطوات 1.7 و 1.8 حتى يتم الكشف عن التعليق الشحمي إلى ما مجموعه 11 دورات التجميد/ذوبان الجليد.
    ملاحظه: وقد أظهرت دورات التجميد/الذوبان المتكررة للحد من مولتيلاميلاريتي23، وهو أمر بالغ الاهميه لدقه المقايسة الشحمية واحده ، كما الجسيمات الشحمية مولتيلاميلار سوف انحراف كثافة فلوري مقابل نسبه حجم الشحمية من الجسيمات الشحمية. و multilamellarity عاده منخفضه بطبيعتها عندما بما في ذلك أكثر من 0.5 ٪ الدهون PEGylated في صياغة (مثل عاده في الدهنية لتسليم المخدرات)24.
  10. البثق تعليق الشحمية مره واحده من خلال فلتر البولي 800 nm باستخدام مجموعه البثق مصغره. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لتجميع مجموعه البثق (انظر جدول المواد).
  11. تخزين الجسيمات الشحمية في 4 °C بين عشيه وضحيها.

2. اعداد سطح غرفه التصوير

  1. اعداد الزلال المصل البقري (الجيش الصربي البوسني ؛ 1 ملغ/مل) ، صربا-البيوتين (1 ملغ/مل) و العقديات (0.025 ملغ/مل) في 10 ملم HEPES (4-(2-هيدروكسي ايثيل) حمض -1-بيبيرازينيثانيسولفونيك) 95 mM NaCl العازلة (HEPES العازلة).
    ملاحظه: لمنع انفجار الشحمية ، يجب ان يكون المخزن المؤقت السوربيتول المستخدمة للاماهه والعازلة HEPES المستخدمة لاعداد السطح متساوي النظير. ولذلك فمن المستحسن للتحقق من الاسموليه من المخازن المؤقتة قبل التجربة.
  2. مزيج 1,200 μL من جيش صرب الجمهورية و 120 μL من صرب البوسنيين البيوتين وأضافه 300 μL من الخليط إلى كل بئر في 8 شريحة جيدا لمجهر.
    ملاحظه: نحن هنا استخدام المتاحة تجاريا 8 الشريحة المجهر جيدا مع أسفل الزجاج (انظر جدول المواد) ، ولكن يمكن بسهوله تكييف البروتوكول لغرف المجهر مخصصه.
  3. احتضان الشريحة لمده 20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT).
  4. اغسل الشريحة 8x مع 300 μL من المخزن المؤقت HEPES.
    ملاحظه: يجب الحرص علي عدم ترك الآبار دون العازلة لأكثر من بضع ثوان ، كما تجفيف السطح سوف تضر به. وعلاوة علي ذلك ، يجب الحرص علي عدم خدش السطح مع طرف ماصه لان هذا سوف يضر أيضا. وهكذا ، عندما يستنشق العازلة من بئر ، تفعل ذلك من الحافة أو الزاوية.
  5. أضافه 250 μL من العقديات واحتضان لمده 10 دقيقه في RT.
  6. كرر 8 يغسل الموصوفة في الخطوة 2.4.
  7. تخزين الشريحة المجهر مع 300 μL من العازلة السوربيتول في كل بئر في 4 ° c. تبخر المذيب سوف يضر السطح ، لذلك وضع الشريحة المجهر في طبق بيتري وختم مع بارافيلم ما لم يتم استخدام الشريحة المعدة علي الفور.

3. الشحمية التجميد

  1. تمييع تعليق الشحمية إلى حوالي 20 μM مجموع الدهون في العازلة السوربيتول. الاجراء في القسم 1 سوف تسفر عن تعليق الشحمية من ما يقرب من 10 ملم الدهون الكلي.
  2. ضع الشريحة علي المجهر والتركيز علي سطح الغرفة باستخدام زيادة انعكاس الليزر اشاره من واجهه الزجاج/العازلة كدليل.
  3. غسل الغرفة 4x مع 300 μL من العازلة HEPES الطازجة.
  4. أضافه 10 μL من الأوراق المالية المخففة الأسهم (20 μM مجموع الدهون) إلى أنبوب الطرد المركزي.
  5. إخراج 100 μL من العازلة من الغرفة ، أضافه إلى أنبوب الطرد المركزي أعدت في الخطوة 3.4 ، وتخلط بشكل صحيح ، ووضع 110 μL مره أخرى إلى الغرفة.
  6. وضع العينة تحت المجهر ، واستخدام الاعداد المجهر اولي قادره علي الكشف عن اشاره من فلوفيموري الشحمية (ق) لمراقبه الدهنيات يجري المعبئة علي السطح.
  7. الهدف لكثافة سطح الشحمية التي هي في وقت واحد متفرق بما فيه الكفاية ل indentify الدهنية الفردية وكثيفه بما يكفي انه يسهل القياسات عاليه الانتاجيه. عاده باستخدام 50 μm x 50 μm مجال الرؤية ، 300 − 400 الدهنية لكل اطار هو الأمثل (الشكل 2). ويمكن تحقيق ذلك عاده في غضون 5 − 10 دقيقه.
    ملاحظه: إذا تم الكشف عن جزيئات الفلورسنت تتحرك بسرعة فقط في مجال الرؤية ، وغياب أو تركيز منخفض جدا من اي من المكونات الهامه لعمليه التجميد (جيش صرب الجمهورية-البيوتين ، العقديات ، منشطات-PEG-البيوتين) قد يكون السبب. إذا لم يتم الكشف عن الجسيمات الشحمية قد تكون مرتبطة بتركيز منخفض من الجسيمات الشحمية ، وإعدادات غير لائق للكشف عن الفلورية ، أو التصوير المحتمل مع الطائرة البؤرية ليس علي سطح الزجاج.
  8. بمجرد الوصول إلى كثافة سطح الشحمية المناسبة ، وغسل الغرفة 3x مع 200 μL من HEPES العازلة.
    ملاحظه: يجب ان تدرك ان حركيه التجميد تعتمد أيضا علي خصائص الشحمية مثل الحجم والشحن ، التالي يجب ان تكون دائما الأمثل لكل تركيبه الشحمية.

4. الحصول علي الصورة

ملاحظه: سيعتمد هذا القسم كثيرا علي نظام المجهر المتاح للباحث الذي يقوم بالتجربة. التالي ، سيتم وصف المبادئ التوجيهية العامة بشان كيفيه أداء التصوير. ومع ذلك ، فان الإعدادات الدقيقة وكيفيه تطبيقها تختلف بين الاجهزه المجهر مختلفه. علي سبيل المثال ، تسمح بعض الانظمه باختيار تركيبه مرشح الانبعاثات المطلوبة ، في حين ان المجاهر الأخرى مجهزه بفلاتر محدده مسبقا.

  1. اعداد المجهر للتصوير الدهنيات واحد. لضمان جوده الصورة المثلي وتحليل البيانات اللاحقة استخدام دقه رمادية عاليه ونظام بكسل التي تسمح لأخذ العينات الدهنية الفردية. ويوصي عمق قليلا من 16 وعلي الأقل 1,024 x 1,024 بكسل لمنطقه 50 μm x 50 μm. إذا كانت متوفرة ، يمكن تطبيق متوسط الخط بشكل مفيد للحد من الضوضاء (علي سبيل المثال ، 3 مسح لكل سطر).
  2. حدد قوه الليزر الاثاره التي تضمن كلا من الإطار إلى اطار التبييض واشاره قويه بما فيه الكفاية للتمييز بوضوح الجسيمات الشحمية الفردية من الخلفية. سيعتمد الاعداد الأمثل علي المجهر المحدد المستخدم ، فضلا عن تركيبه الفلوكوفيري. تاكد من ان كاشفات ليست مشبعه ، وهذا سوف التحيز القياس الكمي كثافة.
  3. التصوير علي حد سواء Atto488 ومخدرات Atto655 فلوفورس في الجسيمات الشحمية يتطلب التصوير قنوات متعددة. التالي ، تاكد من ان كل قناه يتم بشكل تسلسلي لتجنب الاثاره عبر. علي سبيل المثال ، أولا التقاط صوره واحده من خلال مثيره في 488 nm والانبعاثات القراءة في 495 − 560 نانومتر. بعد ذلك ، تاخذ صوره أخرى من خلال مثيره في 633 nm ولكن القراءة الانبعاثات فقط في 660-710 نانومتر. التفاصيل سوف تعتمد علي نظام المجهر (علي سبيل المثال ، التي الليزر والفلاتر) المتاحة.
  4. تاكد من تغطيه مناطق مختلفه من السطح ، والحصول علي ما لا يقل عن 10 صور من العينة ، التالي التصوير علي الأقل 3,000 الدهنية الفردية. إذا كانت كثافة السطح اقل من 300 الدهنية/الإطار ، والحصول علي المزيد من الصور. تاكد من أعاده تركيز المجهر لكل صوره جديده.
    ملاحظه: بالنسبة للتصوير علي قناتين ، تاكد من تسميه ملفات الصور بحيث يمكن بسهوله تحديد أزواج الصور التي تحتوي علي نفس الجسيمات الشحمية في قنوات فلورية مختلفه اثناء تحليل البيانات.
  5. من أجل تحديد كميه الارتياب التجريبية المتعلقة بقياس التجانس التركيبي ، صوره نفس المنطقة من الدهنيات قبل وبعد أعاده التركيز (انظر الشكل 3 والوصف في النص).
  6. تصدير الصور من برنامج المجهر كملفات .tiff. تصدير قناتين من نفس الجسيمات الشحمية بشكل فردي.

5. تحليل البيانات

ملاحظه: تم وضع الإجراءاتالمناسبة اليه ثنائيه الابعاد التيتم تطويرها بشكل خاص في السابق6،11،12. ومع ذلك ، ولزيادة قابليه تطبيق الأسلوب ، يتم وصف عمليه تحليل البيانات التي يمكن تنفيذها بسهوله في جميع المختبرات.

  1. قم بتحميل الزوج المطابق من الصور. tiff لقناين مختلفتين في نفس مجال التصوير في برنامج فيجي (فيجي هو فقط ImageJ).
  2. في القائمة صوره ، اختر اللون، واستخدم وظيفة دمج القناة لإنشاء مركب من القناتين.
  3. لاحظ إذا كانت الجسيمات الشحمية في قناتين مختلفتين تعرض التنظير الجيد أو ما إذا كان الانحراف المرئي قد حدث.
    ملاحظه: في حاله الانجراف بين القناتين مضان (المعترف بها باعتبارها تعادل X-Y منتظمة ومتساوية بين اشاره في القناتين) ، واحده من الإطارات يمكن ترجمتها باستخدام تحويل ≫ ترجمه وظيفة في القائمة صوره فيجي. ومع ذلك ، ينبغي توخي الحذر مع مثل هذه التلاعب الصورة. التالي فمن المستحسن ان تجنب بدلا من ذلك الانجراف قدر الإمكان عند تصوير الشحمية.
  4. تاكد من تثبيت المساعد ComDet (0.3.6.1 أو أحدث) ، أو القيام بذلك في قائمه الإضافات .
  5. فتح المساعد ComDet للكشف عن الجزيئات عن طريق الذهاب إلى القائمة الإضافات واختيار comdet 0.3.6.1 > الكشف عن الجسيمات.
  6. في ComDet ، تاكد من اختيار الجسيمات الكشف علي كل القناات وظيفة بشكل فردي . تعيين المسافة القصوى بين المواقع المترجمة المشتركة مماثله لحجم الجسيمات التقريبية. عاده ، 4 بكسل هو المناسب للإعدادات الموصوفة هنا.
  7. يجب ان تسمح نسبه الاشاره إلى الضوضاء بالكشف عن الجزيئات الخافتة حتى مع انخفاض كميه الفلورية. في ComDet ، تعيين هذه النسبة إلى 3 عن طريق تحديد حساسية الكشف في كلا القناتين إلى جزيئات خافت جدا (الاستخبارات = 3).
    ملاحظه: في حين ان هذه القيمة الاستخبارات عاده ما تكون مناسبه ، قد يكون من الضروري لتعيينها اعلي (علي سبيل المثال ، إذا كان هناك الكثير من الضوضاء الصورة التي يمكن التعرف علي انها الشحمية ويؤدي إلى إيجابيات كاذبه).
  8. تاكد من المربعات مع حساب التنظير والجسيمات كشف المؤامرة في كلا القناتين يتم التحقق ، قبل الضغط OK.
  9. بعد تشغيل التحليل ، سيتم عرض إطارين منبثقين مع نتائج وملخص . تصدير نتائج جدول البيانات التي تحتوي علي بيانات التنظير (إحداثيات الجسيمات والكثافة المتكاملة لكل جسيم تم اكتشافه) إلى برنامج معالجه البيانات الذي يتم اختياره من خلال حفظ الجدول كملف .txt واستيراده إلى البرنامج.
  10. تاكد من ان كل الشحمية يتم تضمينها مره واحده فقط في مجموعه البيانات وليس كل من channel1/channel2 وكذلك channel2/channel1 نسبه. التالي ، تصفيه البيانات لذلك فقط Abs_frame = 1 يتم رسمها في الخطوة 5.11.
    ملاحظه: عن طريق اختيار Colocalized = 1، يمكن أزاله إيجابيات كاذبه من الضوضاء في الصور من التحليل. ومع ذلك ، فان اي الجسيمات الشحمية مع واحد فقط من اثنين من المكونات الفلورية الحالية سوف تستبعد أيضا من التحليل ، التالي يحتمل أزاله نقاط البيانات الهامه من التحليل.
  11. ارسم الرسم البياني للعمود مع البيانات التي تحتوي علي نسبه الكثافة لكل ليبوسوم المكتشفة.
  12. يتم تمثيل درجه التجانس التركيبي للنظام الشحمي المدروس بعرض توزيع نسبه الكثافة. لقياس التجانس ، وتناسب نسبه كثافة الرسم البياني مع وظيفة غوسيه واستخراج المتوسط (μ) والانحراف المعياري (سيغما). راجع قسم النتائج التمثيلية.
  13. يمكن الآن حساب قيمه لدرجه عدم التجانس (DI) باستخدام معامل التباين المعرف باسم DI = سيغما/μ.

6. معايره الحجم الليليسوم

  1. إخراج جزء من الأسهم الشحمية ، و البثق 21x من خلال فلتر البولي 50 nm كما هو موضح في الخطوة 1.10.
  2. تمييع الجسيمات الشحمية عن طريق أضافه 10 μL من تعليق الشحمية إلى 800 μL من العازلة السوربيتول في أنبوب ميكروطارد للطرد المركزي.
  3. نقل عينه الدهنية المخففة إلى البولي بروبيلين واحده--استخدام cuvette.
  4. قياس الحجم باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS). أداء ما لا يقل عن ثلاثه أشواط مستقله لقياس حجم والتشتت من تعليق الشحمية.
    ملاحظه: إذا لزم الأمر ، استخدم تعليق ليبوسوم أكثر تركيزا للقياس. يمكن أيضا تطبيق بدائل DLS (علي سبيل المثال ، تحليل تتبع جسيمات متناهي) لقياس حجم الشحمية. وان وصف كيفيه تنفيذ هذا التحديد لحجم الجسيمات يتجاوز نطاق هذا البروتوكول.
  5. صوره الشحمية المعايرة علي المجهر باستخدام نفس الإعدادات التجريبية بالبالضبط كما هو محدد في الخطوات 4.1 و 4.2.
  6. استخراج كثافة متكاملة لكل الدهنية المعايرة في الصور المعايرة: استخراج ورقه النتائج المصفاة التي تحتوي علي كثافة مضان الشحمية كما هو موضح في الخطوات 5.1 − 5-10. من جدول النتائج ، استخراج العمود "تكامل".
  7. لان إجمالي كثافة متكاملة من الشحمية المسمية في غشاء لها يتناسب مع المساحة السطحية من الشحمية التالي يتناسب مع مربع من قطرها ، مؤامرة الرسم البياني كثافة الجذر التربيعي لكثافة مضان لل الدهنية المعايرة.
  8. تناسب المدرج التكراري كثافة المتكاملة التي تم إنتاجها في الخطوة 6.7 مع توزيع السجل العادي واستخراج متوسط كثافة الفلورية من الدهنيات المعايرة.
  9. لتحديد العلاقة بين كثافة الجذر التربيعي (الباحثSqrt) وحجم الشحمية ، حساب عامل التصحيح (C) باستخدام متوسط قطر الشحمية (ضياء) وزنها العدد الذي تم الحصول عليه من القياسات dls: ضياء = c x IntSqrt يعادل c = ضياء/intsqrt.
  10. حساب القيمSqrt الباحث عن الجسيمات الشحمية في تجربه التجانس التركيبي وتحويل هذه إلى أقطار عن طريق ضرب مع عامل التصحيح.
  11. ارسم قيمه نسبه الكثافة كداله قطر للدهنيات التركيبية غير المتجانسة ، التالي تحقيق التجانس كداله لحجم الشحمية لعدد سكان الجسيمات الشحمية التي تمتد من حوالي 50 نانومتر − 800 نانومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد البروتوكول الموصوف يجعل من الممكن لصوره الجسيمات الشحمية واحد بطريقه متوازية ضخمه (الشكل 1). التجميد السطحي الناجح من الجسيمات الشحمية يجب ان يكون واضحا علي الفور عند أضافه محلول الليبوسوم إلى الغرفة (الخطوة 3.6 في البروتوكول) كما ينبغي ان تظهر بقع شده الانكسار المحدودة في الصورة (الشكل 1ب والشكل 1ج).

من أجل تحقيق إحصاءات جيده واستغلال قدرات عاليه الانتاجيه من الفحص ، يجب ان تكون عده آلاف من الدهنيات imaged. من أجل القيام بذلك في عدد معقول من الصور ، فمن المستحسن لشل ما يكفي من الشحمية لتحقيق كثافة من 300 − 400 الدهنية لكل اطار ، لان هذا سيجلب عدد الصور لكل عينه وصولا إلى ~ 10 ، التالي الحد من عدد الصور التي يجب ان يتم الحصول عليها وتحليلها. وانخفاض كثافة جعل تحليل البيانات أكثر استهلاكا للوقت ، في حين ان كثافة اعلي يمكن ان تجعل من الصعب علي برنامج تحليل الصور للتمييز الدهنيات واحد. للحصول علي انطباع مرئي لما 300 − 400 الدهنية تبدو وكانها ، انظر الشكل 2ا. وتجدر الاشاره مع ذلك إلى انه بالنسبة لبعض التطبيقات (علي سبيل المثال ، تفاعلات البروتين الغشائي مع البروتين الذي يميل إلى الحصول علي خلفيه قويه لسطح الجيش الصربي البوسني) فمن المستحسن استخدام كثافة اقل قليلا ، كما في الشكل 2ا في اعلي اليمين.

في بعض الأحيان ، عند الحصول علي الصور من الصعب الحصول علي مجال الرؤية بأكمله في التركيز المناسب ، كما هو موضح في الشكل 2ب. هذه القضايا قد تشير إلى ان لوحه عينه يميل ، والتي يمكن ان تنشا من لوحه لا يتم وضعها بشكل صحيح علي حامل العينة علي المجهر. أيضا ، إذا كانت الدهنية تبدو كبيره وضبابية ، قد تبخرت العازلة في الغرفة وجفت السطح. ومن المهم بشكل خاص إبقاء هذه المسالة في الاعتبار عند التصوير لفترات زمنيه طويلة أو عند اجراء القياسات في درجات حرارة اعلي من RT. لتوضيح الفرق بين الجسيمات المخزنة والمجففة بشكل صحيح ، وتظهر صوره من نفس العينة قبل وبعد تجفيف خارج الغرفة في الشكل 2ج.

بعد التاكد من جوده الصورة المثلي ، يمكن استخراج كثافة متكاملة لكل الشحمية في قناتي التصوير بعد الخطوات المذكورة في القسم 5 من هذا البروتوكول. القيام بذلك سيخلق قائمه من القيم كثافة فريدة من نوعها ، مما يسمح لنا لحساب نسبه كثافة لكل الدهنية الفردية. ويتم تقييم التجانس التركيبي من الرسوم البيانية لنسبه الكثافة ، والتي تكشف عاده عن توزيع غاوسي حول قيمه النسبة المتوسطة (الشكل 3ا). لاحظ انه إذا لوحظت انحرافات قويه من توزيع غاوسي (الشكل 3ب) ، فانه يشير إلى وجود مشكله حساسية الكشف لواحد علي الأقل من قنوات التصوير ، مما يوحي بان مجموعه فرعيه من الجسيمات الشحمية التي تظهر اشاره أضعف قد استبعدت. وقد يرجع ذلك إلى حد الكشف عن نظام التصوير ، أو باستثناء الدهنيات في تحليل البيانات (علي سبيل المثال ، عند تطبيق حد ادني معين ؛ انظر الخطوة 5.7).

حساب قيمه DI كما هو موضح في الخطوات 5.11 − 5-13 في البروتوكول سيوفر قياس كمي لعدم تجانس التركيبية بين الشحمية الفردية للتحضير. لنظام الشحمية درس هنا ، DI = 0.23 ± 0.01 (الشكل 3ج). هذه القيمة يمكن استخدامها للمقارنة بشكل منهجي كيف تختلف خصائص الشحمية أو أساليب التحضير تؤثر علي التجانس التركيبي. لتصور معني قيمه DI ، نشير إلى التوزيع العادي المعروض بنسبه كثافة الرسم البياني ، وهذا يعني انها سوف يطيع التجريبية 68 -95-99.7 القاعدة. توضح هذه القاعدة النسبة المئوية لعدد السكان الذي يقع ضمن الانحرافات المعيارية الواحدة والثانية والثلاثة حول القيمة المتوسطة. لقيمه DI 0.23 ± 0.01 وجدت هنا ، فهذا يعني ان 32 ٪ من الجسيمات الشحمية في السكان سيكون لها نسبه الكثافة التي تختلف بأكثر من 23 ٪ من متوسط نسبه المولي من الفرقة (الشكل 3د).

لتجربه التحكم التصوير نفس الجسيمات الشحمية قبل وبعد أعاده التركيز (القسم 4.6) ، يتم تنفيذ نفس تحليل البيانات والتامر نتيجة للتجربة الفعلية. القيام بذلك يسمح للقياس الكمي لعدم اليقين التجريبية للقيمة DI ، الذي وجد انالارتياب di = 0.10 ± 0.01 (الشكل 3ه). علي الرغم من ان قيمهالارتياب DI تعتمد علي نظام التصوير المستخدمة ، وجد ان الاجهزه المجهر البؤري تؤدي باستمرار إلى القيم ديعدم اليقين من حوالي 0.105،6. قيمه DI من DI = 0.23 ± 0.01 العثور علي النظام الشحمي هنا هو أكثر من ضعف الارتياب التجريبية ، مما يوحي بوجود التجانس التركيبية كبيره بين الدهنيات الفردية للتحضير.

ان اجراء تجربه معايره الحجم الموصوفة في القسم 6 سيسمح بتحويل قيم شده الشحمية التعسفية إلى أقطار طبيعيه في نانومتر. وقد تم التحقق من الأسلوب ضد تقنيات التصوير الأخرى25 مثل المجهرية الكترون المبردة ، والتي لديها القدرة علي حل بصريا الجسيمات الدهنية الحجم نانومتر ، علي الرغم من الانتاجيه اقل بكثير. تصوير عينه التحكم باستخدام نفس إعدادات المجهر بالبالضبط كما استخدمت للتجارب الفعلية ، فمن الممكن الآن لربط كثافة الدهنية يعني إلى قطر الدهنية يعني يحددها DLS (الشكل 4ا). الخطوة التالية هي لتصوير توزيع كثافة الدهنية ، والتي تقوم علي القيود المادية ضد خلق الجسيمات الشحمية الصغيرة للغاية ، وعاده ما يعرض التوزيع العادي سجل (الشكل 4ب). إذا لم يتم وصف التوزيع بشكل جيد من قبل التوزيع العادي سجل (في معظم الأحيان بسبب الدهنيات المفقودة مع قيم كثافة منخفضه) فهذا يعني ان جزءا من السكان الشحمية تم استبعاد اما بسبب حساسية الكشف عن المجهر منخفضه أو المعلمات صارمة للغاية اثناء تحليل البيانات (الشكل 4ج). ومن المهم الإمساك بهذه القضايا ومعالجتها لضمان تفسير البيانات بشكل غير متحيز. وبعد ذلك ، يمكن تحويل قيم الكثافة الخاصة بكل من الليلينوم الفردية في الشكل 4ب إلى أقطار فعليه باستخدام عامل التصحيح المحدد في الشكل 4(ا ) (الشكل 4د). بعد تحديد حجم كل الشحمية ، يمكن الآن التحقيق في دي كداله لقطر بالتامر علي نسبه كثافة مقابل القطر لكل الدهنية الفردية (الشكل 4ه). تدعم بنيه البيانات الشبيهة بالقمع النتائج السابقة التي تزيد من قيمه DI عندما ينخفض حجم الشحمية6. والاهم من ذلك ، تشير الزيادة المتناظرة في انتشار نسب الكثافة حول القيمة المتوسطة إلى انه لا يوجد تباين منهجي يعتمد علي الحجم في التكوين الوسطي للاسبومات الشحمية.

Figure 1
الشكل 1: الفحص الشحمي الواحد. (ا) يتم وضع الشحمية مع محتوي متساوي من الفلوريسسينتلي المسمي الدهون ATTO488 المخدرات وATTO655 المخدرات والتي تم تعبئتها علي سطح جيش صرب البوسنيين باستخدام الربط البيوتين/العقديات. (ب) الجسيمات الشحمية غير المعباه هي التي تستخدم المجهر البؤري المركزي ، مما يسمح بالكشف عن الكثافات الفلورية من الجسيمات الشحمية الواحدة. قضبان المقياس = 8 μm. (ج) تكبير المنطقة الخضراء في (ب) المبينة كمؤامرة لكثافة السطح لاثنين من الدهنيات المجاورة التي تظهر اشاره الفلورسنت المقلوبة بين القناتين ، مما يوضح مفهوم التجانس التركيبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التحسين والمزالق. (ا) يظهر اليسار العلوي 29 الشحمية المعبئة في اطار 50 μm x 50 μm. هذه هي عدد قليل جدا من الدهنية لكل اطار لاستغلال امكانيه التحقيق عاليه الانتاجيه من التجانس الشحمي. يظهر اليمين العلوي 123 الدهنية لكل اطار. هذه هي كثافة دون الأمثل ولكن يمكن استخدامها إذا تم الحصول علي العديد من الصور. يظهر أسفل اليسار 300 − 400 الدهنية لكل اطار. هذا هو الأمثل للبروتوكول الموصوف هنا. يظهر اليمين السفلي أكثر من 1,500 الجسيمات الشحمية لكل اطار ، وهو عدد كبير جدا لتمييز الجسيمات الشحمية الفردية. هناك خطر كبير ان بقعه واحده في الواقع سيكون اثنين من الجسيمات الشحمية شلت داخل نفس البقعة المحدودة الانكسار. (ب) إذا لم يتم وضع الغرفة بشكل صحيح في حامل العينة ، سيكون من المستحيل الحصول علي كامل مجال الرؤية في التركيز المناسب. في الرسم البياني الأيسر اللوحة يميل حول محور الاجتياز ، مما ادي إلى الزاوية اليسرى السفلي يجري خارج التركيز. في الرسم البياني الأيمن اللوحة يميل حول المحور الطولي ، مما ادي إلى أماله أثقل. كل من أسفل اليسار والزاوية اليمني العليا خارج التركيز. (ج) إذا كان التصوير لفترات زمنيه طويلة أو في درجات حرارة مرتفعه قد يتبخر العازل ، مما يؤدي إلى تجفيف خارج الغرفة. وضحنا هذا السيناريو هنا عن طريق التصوير الشحمية قبل وبعد ترك الغرفة لتجف لمده 3 دقائق ، ومن ثم أعيد ترطيب عن طريق أضافه العازلة الطازجة إلى الغرفة. الجسيمات الشحمية الناتجة هي أكبر ، ضبابية ، وانخفاض كثافة الفلورية ، ويبدو ان انتشرت علي لوحه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: نسبه الكثافة البيانية لقياس التجانس الموضعي للودهني. (ا) نسبه كثافة ATTO488 المخدرات والمخدرات-Atto655 فلوري لكل الدهنية الفردية التي رسمت كمدرج تكراري. (ب) توزيع الغوسيه المقتطع الذي يوضح مساله حساسية محتمله ، اما اثناء التصوير أو في خطوه معالجه البيانات. (ج) تركيب الرسم البياني كثافة مع وظيفة غوسيه يجعل من الممكن لاستخراج المتوسط والانحراف المعياري المستخدمة لحساب قيمه DI. (د) يمكن ترجمه القيمة المضافة ل0.23 إلى 32 في المائة من السكان الذين تختلف نسبتهم بأكثر من 23 في المائة عن متوسط النسبة المولية للفرقة. (ه) مراقبه تجربه التصوير نفس الجسيمات الشحمية قبل وبعد أعاده التركيز ثم تنفيذ نفس اجراء معالجه البيانات بالنسبة للتجربة الفعلية. وهذا يسمح بتحديد الخطا التجريبي للقياس الكمي ل DI. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحويل كثافة ليبوسوم إلى القطر المادي في نانومتر. (ا) كثافة الرسم البياني لل 50 nm مقذوف الدهنية معايره مقارنه مع dls البيانات من أجل تحديد عامل المعايرة. (B) الرسم البياني للقيمةsqrt Int من الجسيمات الشحمية التجريبية عاده ما ينتج عنه توزيع السجل العادي بسبب القيود المادية ضد إنشاء الجسيمات الشحمية الصغيرة جدا. (ج) يشير الرسم البياني للقيمةsqrt Int غير العادية غير السجل إلى المشكلات المتعلقة بحساسية الكشف أو انه تم استبعاد الجسيمات الشحمية الصغيرة اثناء معالجه البيانات. (د) يتم تحويل شده الشحمية في (ب) إلى أقطار الشحمية الفعلية باستخدام عامل التصحيح. (ه) ويمكن الآن نسبه كثافة كل الشحمية التي رسمت كداله لقطر الشحمية يمكن عرضها السماح للتحقيق في التجانس التركيبي كوظيفة من حجم الشحمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

من المهم ان نلاحظ انه في حين اننا وصف بالتفصيل كيف يمكن استخدام المقايسة الشحمية واحده لدراسة التجانس التركيبي بين الدهنية الفردية ، ومنصة متعددة جدا. كما هو مبين سابقا ومناقشتها في المقدمة ، يمكن تكييف البروتوكول بسهوله لدراسة جوانب من الانصهار غشاء غشاء ، والتفاعلات غشاء البروتين ، أو توصيف الناقل المخدرات الشحمية. النسبة لأي اسئله علميه يجري تناولها ، تكمن قوه المقايسة الشحمية الوحيدة في القدرة علي الكشف عن المكونات الفردية للفرقة التالي الحصول علي قراءات كميه ، وليس متحيزا بتاثيرات متوسطه للفرقة.

المقايسة الشحمية الواحدة هي مناسبه علي النحو الأمثل لطرائق التصوير السطحي مثل التفكير الداخلي الكلي أو المجهر البؤري ، حيث يمكن ان يزيل الاتجاه المعاكس الخلفي غير المرغوب فيه من المحلول فوق طبقه الشحمية. ومع ذلك ، هذا الجانب هو الأكثر اهميه للدراسات حيث يتم أضافه المركبات المسمية فلوريسسينتلي ، مثل الببتيدات ، والبروتينات ، أو الدهنية الأخرى إلى الحل وتبقي هناك اثناء التصوير. علي سبيل المثال ، إذا تم استخدام المقايسة في التنسيق الموصوف بالتفصيل هنا ، حيث تقتصر الاصباغ الفلورية علي الجسيمات الشحمية غير المعباه ، يمكن ان يتم الفحص في المبدا باستخدام المجاهر ويديفيلد المتاحة علي نطاق واسع ، مما يوفر الكشف عن نظام حساس بما فيه الكفاية.

بداهة لا توجد قيود فيما يتعلق بالطريقة المستخدمة لاعداد الشحمية المستخدمة في الفحص. هنا نقوم بوصف بالتفصيل استخدام تقنيه التجفيف بالتجميد. ومع ذلك ، استخدمت في السابق المستندة إلى كلوروفورم الدهون الاماهه أو التقنيات القائمة علي حقن الايثانول لافتعال الشحمية المستخدمة في الفحص5,6. المعلمة الحرجة هي ادراج جزء صغير من الدهون الحيوية في خليط الدهون لضمان عدم التعبئة (0.05 النسبة المئوية الموصي بها). عنصر ضروري آخر هو تضمين كميه صغيره من فلوريسسينتلي المسمية الدهون. عموما ، ينبغي الاحتفاظ بكميه الدهون صبغ المضافة منخفضه قدر الإمكان لتجنب اثار التبريد وتجنب الدهن صبغ من تغيير كبير في الخصائص الفيزيائية الكيميائية من الشحمية. يتم تعيين الحد الأدنى من كميه صبغ الدهون من قبل التركيز ، حيث التباين العشوائي في عدد الاصباغ الدهنية الفردية لكل الشحمية يصبح كبيرا بالمقارنة مع متوسط كميه الاصباغ الدهنية (انظر لارسن وآخرون6 لاجراء مناقشه متعمقة). الذهاب تحت هذا الحد سوف اعرض الشكوك الكبيرة في كثافة المستخرجة. وأخيرا ، فان كميه صبغ الدهون يحتاج إلى ان تكون عاليه بما يكفي للكشف عن دقيقه من الجسيمات الشحمية واحد مع نسبه جيده اشاره إلى الضوضاء. في حين ان هذا المعيار بالطبع يعتمد اعتمادا كبيرا علي نظام التصوير ، وجدنا ان تركيزات صبغ الدهون بين 0.05 و 0.5 مول ٪ تعمل بشكل جيد في الغالبية العظمي من الحالات.

لاختيار اي صبغ الدهون لتشمل في الشحمية ، والشرط الأساسي الأول هو ان خصائص الاثاره والانبعاثات تتطابق مع قدرات الاضاءه والكشف من نظام التصوير. ثانيا ، لزيادة حساسية ودقه الطريقة نوصي باستخدام الاصباغ مع كل من غله الكم العالية والاستقرار الضوئي ، ونحن قد استخدمت سابقا بنجاح الاصباغ مع موجات الاثاره المختلفة6،11. وينبغي توخي الحذر في اختيار المراسي الدهون مع خصائص فيزيائية مماثله لضمان ان تقسيم الدهون لا يؤدي إلى التجانس عاليه مصطنع. علي سبيل المثال ، بالنسبة لهذا البروتوكول ، قمنا بالارتكاز علي كل من الفلوروبيورس باستخدام المنشطات ، في حين ان وجود فلوفيموري واحد علي المخدرات واخر علي DPPE يمكن ان يؤدي إلى تغاير التوزيع فلوروكوفيري لا تتعلق بالتجانس المتاصل في السكان الدهنيين. خاصه بالنسبة للتصوير بألوان المزدوجة من المهم اختيار الاصباغ مع الاثاره الضيقة وأطياف الانبعاثات وأصغر تراكب الطيفية ممكن لتجنب نزيف كبير من خلال ، الحديث المتقاطع ، والفلورية نقل الطاقة بالرنين (الحنق) بين الاصباغ والقناات. لتجنب القطع الاثريه المتعلقة بالاختلاف في بيئة فلوكوفيتور نفضل العمل مع الاصباغ ، والتي ثبت تجريبيا لإظهار الميل التفاعل غشاء منخفض للغاية كما هو محدد من قبل هيوز et al.26. وأخيرا ، إذا كان تكوين الدهون الدهنية محدده ليست مطلبا صعبا للتصميم التجريبي ، فانه يمكن ان يكون مفيدا لتشمل ما يصل إلى 10 مول ٪ من الدهون مشحونة سلبا لضمان ان الجسيمات الشحمية صد بعضها البعض ويتم تعبئتها بكفاءة كما الدهنيات واحد12.

ميزه من الفحص الشحمي الواحد هو حجم التجريبية الصغيرة ، والتي يمكن ان تقلل كثيرا من كميه المركبات باهظه الثمن أو النادرة المستخدمة في التجربة. هنا نقوم بوصف استخدام الغرف القياسية والمتاحة تجاريا مع حجم تجريبي بين 150 – 300 μL. ومع ذلك ، يمكن استخدام غرف المجهر المصنوعة خصيصا التي يمكن ان تقلل من حجم إلى مجموعه من 50-80 μL. أيضا ، واستهلاك الدهنية منخفضه جدا ، مع تركيز النهائي حول 2 μM مجموع الدهون.

عيب من الفحص الشحمي الواحد هو انه من الصعب السيطرة علي تركيز الدهون في الغرفة بسبب الاختلافات في الميول التجميد الموصوفة أعلاه. بالاضافه إلى ذلك ، فيما يتعلق بتطبيق المقايسة لدراسة التفاعلات غشاء البروتين ، فانه من الصعب تحديد تركيز أو عدد من البروتينات المرتبطة مباشره من كثافة مضان.

عند استخدام الجسيمات الشحمية في الفحص كما نظم نموذج الغشاء (علي سبيل المثال ، لدراسة التفاعل الغشاء من المركبات الفلورية ، الببتيدات ، أو البروتينات) من المهم لضمان انخفاض ملزمه غير محدده لمكونات البروتين التي تسهل تجميد. إذا لم يكن هذا هو الحال ، يمكن الكشف عن اشاره الخلفية العالية التي يمكن ان تمنع الكشف عن ربط محدده إلى الدهنية. إذا تم الكشف عن خلفيه عاليه غير محدده قمنا سابقا بنجاح خفض الخلفية عن طريق تغيير من العقديات إلى المحايدين أو avidin.

أداء الكشف عن الشحمية واحده باستخدام تقنيات أخرى مثل تدفق الخلوية يمكن ان توفر احتمال زيادة الانتاجيه الكشف مقارنه مع الفحص القائم علي المجهر. ومع ذلك ، النظر إلى ان الجهاز الخلوي تدفق الأمثل لدراسة أكبر بكثير وأكثر إشراقا عينات مثل الخلايا ، ونظام الكشف عن معظم ليست حساسة بما فيه الكفاية للكشف عن فلوري ضعيفه نسبيا من الدهنية الفردية. لذلك في حين يتم تطوير جديده وأكثر حساسية تدفق الخلوية الفحص القائم علي المجهر يقدم أفضل حل لتوضيح الدهنية الشحمية عند تنفيذها بكفاءة ورصد آلاف من الجسيمات الشحمية في التجربة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد مول هذا العمل المجلس الدانمركي للبحوث المستقلة [المنحة رقم 5054-00165B].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
8-well microscopy slides (µ slides) Ibidi 80827 Microscopy slides with glass bottom
Avanti Mini Extrusion kit Avanti Polar Lipids 610000 Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare
BSA Sigma A9418
BSA-Biotin Sigma A8549
Cholesterol Avanti Polar Lipids 700000 Traded trough Sigma
Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data
DOPE-Atto488 Atto-Tech AD488-165
DOPE-Atto655 Atto-Tech AD655-165
DOPE-PEG-Biotin Avanti Polar Lipids 880129 Traded trough Sigma
D-Sorbitol Sigma S-6021
Freeze-dryer e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene
Glass vials Brown Chromatography 150903 Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit
HCl Honeywell Fluka 258148
Heating bath Capable of heating to minimum 65 °C
Heating plate with Magnet stirring Capable of heating to minimum 65 °C
HEPES Sigma H3375
Liquid nitrogen Including container for storage, e.g. Rubber-bath
Magnetic stirring bars VWR 442-4520 (EU)
Microcentrifuge tubes 1.5 mL Eppendorf 0030 120.086 (EU)
Microscope For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used
Na HEPES Sigma H7006
NaCl Sigma S9888
NaOH Honeywell Fluka 71686
POPC Avanti Polar Lipids 850457 Traded trough Sigma
Streptavidin Sigma S4762
tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) Honeywell Riedel-de Haën 24127
Ultrapure water e.g. MilliQ

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  2. Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
  3. Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).
  4. Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  5. Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
  6. Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
  7. Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).
  8. Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
  9. Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
  10. Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  11. Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).
  12. Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
  13. Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
  14. Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
  15. Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
  16. Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
  17. Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
  18. Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
  19. Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
  20. Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
  21. Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).
  22. Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
  23. Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
  24. Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
  25. Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
  26. Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 154 ، الجسيمات الشحمية المفردة ، المجهر الفلوري ، التجانس التركيبي ، توصيف الشحمية ، تفاعلات الغشاء البروتيني ، المجهر البؤري
A الكمي الفلورية المجهري القائم علي فحص ليبوسوم واحد للكشف عن التجانس التركيبي بين الجسيمات الشحمية الفردية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Münter, R., Andresen, T. L.,… More

Münter, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes. J. Vis. Exp. (154), e60538, doi:10.3791/60538 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter