En kvantitativ fluorescensmikroskopi-baserad Singelliposomanalys för att detektera sammansättningen av Inhomogeniteten mellan enskilda Lipoer
Summary
Detta protokoll beskriver tillverkningen av liposomer och hur dessa kan immobiliseras på en yta och avbildas individuellt i ett massivt parallellt sätt med fluorescens mikroskopi. Detta gör det möjligt att kvantifiera storleken och sammansättningen ohomogenitet mellan enskilda liposomer av befolkningen.
Abstract
De flesta forskning som sysselsätter liposomer som membran modellsystem eller läkemedel leverans bärare förlitar sig på bulk Läs-ut tekniker och därmed i sig förutsätter att alla liposomer i ensemblen vara identiska. Nya experimentella plattformar som kan observera liposomer på enpartikelnivå har dock gjort det möjligt att utföra mycket sofistikerade och kvantitativa studier av protein-membraninteraktioner eller läkemedelsbärar egenskaper på enskilda liposomer, därmed undvika fel från Ensemble medelvärdes. Här presenterar vi ett protokoll för beredning, detektering och analys av enstaka liposomer med hjälp av en fluorescensbaserad mikroskopi-analys som underlättar sådana enpartikelmätningar. Installationen möjliggör avbildning enskilda liposomer i ett massivt parallellt sätt och används för att avslöja intra-Sample storlek och sammansättning inhomogeneities. Dessutom, protokollet beskriver fördelarna med att studera liposomer på den enda Liposom nivå, begränsningarna av analysen, och de viktiga funktioner som ska beaktas när du ändrar den för att studera andra forskningsfrågor.
Introduction
Liposomer är sfäriska fosfolipidbaserade vesikler som används tungt både i grundläggande och tillämpad forskning. De fungerar som utmärkta membran modellsystem, eftersom deras fysiokemiska egenskaper lätt kan manipuleras genom att variera lipidkomponenterna som utgör Liposom1,2. Också, liposomer utgör den mest använda drogen leverans nanocarrier system, erbjuder förbättrad farmakokinetik och farmakodynamik samt hög biokompatibilitet3.
Under många år har liposomer främst studerats med hjälp av bulktekniker, vilket ger endast tillgång till ensemblernas genomsnittliga Läs-och skrivvärden. Detta har lett till att majoriteten av dessa studier förutsätter att alla liposomer i ensemblen är identiska. Sådana värden i ensemblen är dock bara korrekta om den underliggande datauppsättningen är jämnt fördelad runt medelvärdet, men kan representera en falsk och partisk slutsats om datauppsättningen innehåller flera oberoende populationer, till exempel. Dessutom, förutsatt att ensemblen betyder att representera hela befolkningen kan bortse från den information som hyste inom inhomogeniteten mellan liposomer. Först nyligen har kvantitativa analyser framkommit som kan sond enstaka liposomer, avslöjar stora inhomogenitetsmätningar mellan enskilda liposomer med avseende på viktiga fysikalisk-kemiska egenskaper inklusive Liposom storlek4, lipid sammansättning5,6, och inkapsling effektivitet7, belyser vikten av att studera liposomer på den enda Liposom nivå.
Ett forskningsområde där Ensemble medelvärde av Liposom egenskaper har visat sig bias resultat studerar Liposom storlek beroende protein-membran interaktioner8,9. Traditionellt, forskare som studerar sådana processer har begränsats till att förbereda liposomer med olika Ensemble genomsnittliga diametrar genom extrudering genom filter med olika porstorlek9. Emellertid, extrahera diametern av enskilda liposomer med enda Liposom analyser har avslöjat stora befolknings överlappningar, med liposomer extruderad med 100 nm och 200 nm filter visar upp till 70% överlappning i deras storleksfördelning4. Detta kan allvarligt bias bulk mätningar av Liposom storlek beroende protein-membran interaktioner10. Utföra membran-protein interaktionsstudier med den enda Liposom analysen, forskarna i stället drog fördel av storleken-polydispersitet i provet, så att de kan studera ett brett spektrum av Liposom diametrar inom varje enskilt experiment, att underlätta nya upptäckter av hur membran krökning och sammansättning kan påverka protein rekrytering till membran4,11,12. Ett annat område där tillämpningen av enstaka Liposom analyser har visat sig instrumentella är i mekanistiska studier av protein-medierad membran fusion13,14. För sådana kinetiska mätningar, förmågan att studera enskilda fusions händelser lindras behovet av experimentell synkronisering av fusionsprocessen, vilket möjliggör nya mekanistiska insikter som annars skulle ha försvunnit i den spatiotemporal medelvärdes mätningar som gjorts i bulk ensemble. Dessutom har enstaka liposomer använts som en membran ställning, vilket gör det möjligt att mäta enskilda proteiner och erbjuda ny kunskap om transmembranproteinstrukturdynamik15,16. Dessutom har sådana proteoliposome-baserade uppställningar gjort det möjligt att studera funktionen hos enskilda transmembrantransportörer17 och Porbildande proteinkomplex18 samt mekanismen för bioaktiva membran-permeabiliserande peptider19. Enstaka liposomer har också använts som mjuk materia nanofluidik med utanpåliggande singelliposomer som fungerar som kammare för enzymatiska reaktioner i volymer på 10-19 L, vilket ökar genomflödet och komplexiteten hos screening analyserna med minimal produkt åtgång20.
Nyligen, enstaka Liposom analyser har använts för att karakterisera drogen leverans liposomer på en tidigare unprecenbucklig detaljnivå. Forskarna kunde kvantifiera betydande inhomogenitetsmätningar i mängden polymer fäst vid ytan av enskilda liposomer21. Den enda Liposom analyser tillät också mätningar av läkemedelsleverans liposomer i komplexa medier, såsom blodplasma, avslöjar hur element förankrade till Liposom ytan genom lipid ankare kan vara mottagliga för dissociation när liposomer utsätts för förhållanden imitera de upplevt under in vivo cirkulation22. Sammantaget är mångsidigheten och nyttan av den enda Liposom analyser bekräftas av den stora variation av problem dessa inställningar har använts för att ta itu med, och vi föreställa att metoden kommer att fortsätta att utvecklas och hitta användning i nya vetenskapliga områden.
Här beskriver vi en fluorescensmikroskopi-baserad enda Liposom analys som gör att enskilda liposomer kan studeras i en hög genomströmning sätt (figur 1). För att illustrera metoden använder vi den för att kvantifiera storleken och sammansättningen av inhomogeniteten mellan enskilda liposomer inom en ensemble. Analysen sysselsätter fluorescens Mikroskop avbildning av enskilda liposomer immobiliserade på en passive rad glasyta. Vi beskriver först de kritiska stegen i Liposom tillverkningsprocessen som säkerställer korrekt fluorescerande Liposom märkning och immobilisering. Sedan, vi beskriver den ytbehandling som behövs för att underlätta Liposom immobilisering innan beskriver förfarandet för att säkerställa lämpliga Liposom ytdensiteter. Vi diskuterar mikroskopi parametrar viktigt för att förvärva högkvalitativa bilder och avgränsa hur man utför enkel dataanalys, vilket gör utvinning av Liposom storlek och kompositionella inhomogenitet. Detta generiska protokoll bör ge en god grund för den intresserade forskaren att utveckla analysen ytterligare för hans eller hennes specifika forskningsintresse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det är viktigt att notera att medan vi beskriver i detalj hur den enda liposomer analysen kan användas för att studera sammansättningen inhomogenitet mellan enskilda liposomer, plattformen är mycket mångsidig. Som tidigare visats och diskuterats i inledningen, kan protokollet lätt anpassas för att studera aspekter av membran-membran fusion, protein-membran interaktioner, eller liposomalt drog bärare karakterisering. För alla vetenskapliga frågor som tas upp, kraften i den enda Liposom analysen ligger i förmå…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av det danska rådet för självständig forskning [Grant Number 5054-00165B].
Materials
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65C | ||
| Heating plate w. Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
References
- Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
- Veatch, S. L., Keller, S. L. Seeing spots: Complex phase behavior in simple membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1746 (3), 172-185 (2005).
- Sercombe, L., et al. Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, 13 (2015).
- Hatzakis, N. S., et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Elizondo, E., et al. Influence of the Preparation Route on the Supramolecular Organization of Lipids in a Vesicular System. Journal of the American Chemical Society. 134 (4), 1918-1921 (2012).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of Inhomogeneity in the Lipid Composition of Individual Nanoscale Liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Lohse, B., Bolinger, P. Y., Stamou, D. Encapsulation Efficiency Measured on Single Small Unilamellar Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14372 (2008).
- Iversen, L., Mathiasen, S., Larsen, J. B., Stamou, D. Membrane curvature bends the laws of physics and chemistry. Nature Chemical Biology. 11 (11), 822-825 (2015).
- Bhatia, V. K., Hatzakis, N. S., Stamou, D. A unifying mechanism accounts for sensing of membrane curvature by BAR domains, amphipathic helices and membrane-anchored proteins. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (4), 381-390 (2010).
- Bhatia, V. K., et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J. B., et al. Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases. Nature Chemical Biology. 11 (3), 192 (2015).
- Larsen, J. B., et al. Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment. Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).
- Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).
- Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).
- Hatzakis, N. S., et al. Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are “Selected” upon Allosteric Regulation. Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).
- Mathiasen, S., et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes. Nature Methods. 11 (9), 931-934 (2014).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).
- Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function. Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).
- Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization. Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).
- Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics. Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).
- Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level. Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807 (2019).
- Münter, R., et al. Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies. Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).
- Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance. European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).
- Nele, V., et al. Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study. Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).
- Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles. Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).
- Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649 (2014).
