Un saggio di liposoma singolo basato sulla microscopia quantitativa per rilevare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi
Summary
Questo protocollo descrive la fabbricazione di liposomi e come questi possono essere immobilizzati su una superficie e immagine individualmente in modo parallelo massiccio utilizzando la microscopia a fluorescenza. Ciò consente la quantificazione delle dimensioni e dell’inomogeneità compositiva tra singoli liposomi della popolazione.
Abstract
La maggior parte delle ricerche che impiegano liposomi come sistemi modello di membrana o portatori di somministrazione di farmaci si basa su tecniche di lettura alla rinfusa e quindi presuppone intrinsecamente che tutti i liposomi dell’ensemble siano identici. Tuttavia, nuove piattaforme sperimentali in grado di osservare i liposomi a livello di particelle singole hanno permesso di eseguire studi altamente sofisticati e quantitativi sulle interazioni proteina-membrana o sulle proprietà dei portatori di farmaci sui singoli liposomi, evitando così gli errori dalla media dell’insieme. Qui presentiamo un protocollo per la preparazione, il rilevamento e l’analisi di singoli liposomi usando un analisi di microscopia basata sulla fluorescenza, facilitando tali misurazioni di particelle singole. L’impostazione consente di imaging singoli liposomi in modo massiccio parallelo e viene impiegato per rivelare le dimensioni intra-campione e le inomogeneità compositive. Inoltre, il protocollo descrive i vantaggi dello studio dei liposomi a livello singolo di liposoma, i limiti del saggio e le caratteristiche importanti da considerare quando lo si modifica per studiare altre domande di ricerca.
Introduction
I liposomi sono vescicole sferiche a base di fosforelipidi che sono fortemente utilizzati sia nella ricerca di base che in quella applicata. Funzionano come eccellenti sistemi di modelli di membrana, perché le loro proprietà fisiochimiche possono essere facilmente manipolate variando i componenti lipidici che compongono il liposoma1,2. Inoltre, i liposomi costituiscono il sistema di nanocarrier per la consegna di farmaci più utilizzato, offrendo una migliore farmacocinetica e farmacodinamica, nonché un’elevata biocompatibilità3.
Per molti anni, i liposomi sono stati studiati principalmente utilizzando tecniche sfuse, dando solo accesso ai valori medi di lettura dell’ensemble. Questo ha portato la maggior parte di questi studi ad assumere che tutti i liposomi nell’ensemble siano identici. Tuttavia, tali valori mediati nell’insieme sono corretti solo se il set di dati sottostante viene distribuito uniformemente intorno al valore medio, ma può rappresentare una conclusione falsa e distorta se il set di dati include più popolazioni indipendenti, ad esempio. Inoltre, supponendo che l’insieme significhi rappresentare l’intera popolazione può trascurare le informazioni contenute all’interno dell’omogeneità tra i liposomi. Solo di recente sono emersi saggi quantitativi che sono in grado di sondare singoli liposomi, rivelando grandi inomogeneità tra i singoli liposomi rispetto a importanti proprietà fisiologiche tra cui la dimensione liposomica4, la composizione dei lipidi5,6, e l’efficienza di incapsulamento7,evidenziando l’importanza di studiare i liposomi a livello singolo liposoma.
Un’area di ricerca in cui è stato dimostrato che l’insieme delle proprietà del liposoma è stato mostrato come bias sta studiando le interazioni liposomidi-proteina-membrana dipendenti dalle dimensioni8,9. Tradizionalmente, i ricercatori che studiano tali processi sono stati limitati alla preparazione di liposomi con diversi diametri medi di insieme per estrusione attraverso filtri con diverse dimensioni dei pori9. Tuttavia, l’estrazione del diametro dei singoli liposomi utilizzando singoli saggi liposomi ha rivelato grandi sovrapposizioni di popolazione, con liposomi estrusa utilizzando 100 nm e 200 nm che mostrano fino al 70% di sovrapposizione nella loro distribuzione di dimensioni4. Questo potrebbe pendizzare gravemente le misurazioni di massa delle interazioni liposomiche tra dimensioni e membranadipendenti da 10. Eseguendo gli studi di interazione membrana-proteina utilizzando il singolo saggio liposoma, i ricercatori hanno invece approfittato della dimensione-polidispersità all’interno del campione, permettendo loro di studiare una vasta gamma di diametri liposomici all’interno di ogni singolo esperimento, facilitando nuove scoperte di come la curvatura e la composizione possono influenzare il reclutamento di proteine alle membrane4,11,12. Un altro campo in cui l’applicazione di saggi a singolo liposomasi si è dimostrata strumentale è negli studi meccanicistici di fusione della membrana mediata da proteine13,14. Per tali misurazioni cinetiche, la capacità di studiare singoli eventi di fusione ha alleviato la necessità di sincronizzazione sperimentale del processo di fusione, consentendo nuove intuizioni meccanicistiche che altrimenti sarebbero andate perse nella media spaziotemporale effettuata nelle misurazioni di massa dell’ensemble. Inoltre, singoli liposomi sono stati utilizzati come scaffold a membrana, consentendo la misurazione di singole proteine e offrendo nuove conoscenze sulla dinamica strutturale delle proteine transmembrane15,16. Inoltre, tali configurazioni a base di proteoliposomi hanno permesso di studiare la funzione dei singoli trasportatori transmembrana17 e dei complessi proteici che formano i pori18, nonché il meccanismo dei peptidi bioattivi a membrana-permeabilizzante19. Liposomi singoli sono stati utilizzati anche come nanofluidica a materia morbida con liposomi singoli immobilizzati sulla superficie che servono come camere per reazioni enzimatiche in volumi di 10-19 L, aumentando la produttività e la complessità dei saggi di screening con un consumo minimo di prodotto20.
Recentemente, sono stati utilizzati saggi a singolo liposomale per caratterizzare i liposomi per la somministrazione di farmaci a un livello di dettaglio precedentemente senza precedenti. I ricercatori sono stati in grado di quantificare significative inomogeneità nella quantità di polimero attaccato alla superficie dei singoli liposomi21. I singoli saggi liposomi consentiti anche misure di liposomi di emissione di farmaci in supporti complessi, come il plasma sanguigno, rivelando come gli elementi ancorati alla superficie liposomica attraverso ancore lipidici possono essere suscettibili alla dissociazione quando i liposomi sono esposti a condizioni che imitano quelli sperimentati durante la circolazione in vivo22. Nel complesso, la versatilità e l’utilità dei saggi singoli liposomi sono corroborate dalla grande varietà di problemi che questi allestimenti sono stati impiegati per affrontare, e inviamo che la metodologia continuerà ad essere sviluppata e a fare uso in nuovi campi scientifici.
Qui descriviamo un saggio a singolo liposoma a base di microscopia a fluorescenza che consente di studiare i singoli liposomi in modo ad alto velocità effettiva (Figura 1). Per illustrare il metodo, lo usiamo per quantificare le dimensioni e l’inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi all’interno di un ensemble. Il saggio utilizza l’imaging al microscopio a fluorescenza di singoli liposomi immobilizzati su una superficie di vetro passiva. Descriviamo innanzitutto i passaggi critici del processo di fabbricazione del liposoma che garantisce una corretta etichettatura e immobilizzazione fluorescente. Quindi, descriviamo la preparazione della superficie necessaria per facilitare l’immobilizzazione liposomale prima di delineare la procedura per garantire densità di superficie liposomiche appropriate. Discutiamo i parametri di microscopia importanti per l’acquisizione di immagini di alta qualità e delineamo come eseguire semplici analisi dei dati, consentendo l’estrazione delle dimensioni liposomiche e l’inomogeneità compositiva. Questo protocollo generico dovrebbe fornire una buona base per il ricercatore interessato per sviluppare ulteriormente il saggio per il suo specifico interesse per la ricerca.
Protocol
Representative Results
Discussion
È importante notare che mentre descriviamo in dettaglio come il singolo assaggio di liposomi può essere utilizzato per studiare l’inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi, la piattaforma è molto versatile. Come precedentemente mostrato e discusso nell’introduzione, il protocollo può essere facilmente adattato per studiare gli aspetti della fusione membrana-membrana, delle interazioni proteina-membrana o della caratterizzazione del vettore di farmaci liposomici. Per qualsiasi problema scientifico affrontato, i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal Consiglio danese per la ricerca indipendente [numero di sovvenzione 5054-00165B].
Materials
| 8-well microscopy slides (µ slides) | Ibidi | 80827 | Microscopy slides with glass bottom |
| Avanti Mini Extrusion kit | Avanti Polar Lipids | 610000 | Consumables (Whatman filters) can be aquired from GE Healthcare |
| BSA | Sigma | A9418 | |
| BSA-Biotin | Sigma | A8549 | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | Traded trough Sigma |
| Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ) | ComDet plugin must be installed. Also, a data handling software (Excel, MatLab, OpenOffice, GraphPad Prism etc.) able to load .txt files will be needed to plot the data | ||
| DOPE-Atto488 | Atto-Tech | AD488-165 | |
| DOPE-Atto655 | Atto-Tech | AD655-165 | |
| DOPE-PEG-Biotin | Avanti Polar Lipids | 880129 | Traded trough Sigma |
| D-Sorbitol | Sigma | S-6021 | |
| Freeze-dryer | e.g. ScanVac Coolsafe from Labogene | ||
| Glass vials | Brown Chromatography | 150903 | Glass vials that can resist snap-freezing in liquid nitrogen. The 8 mL version of the vials has a size that also fits with the syringes of the extrusion kit |
| HCl | Honeywell Fluka | 258148 | |
| Heating bath | Capable of heating to minimum 65C | ||
| Heating plate w. Magnet stirring | Capable of heating to minimum 65C | ||
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Liquid nitrogen | Including container for storage, e.g. Rubber-bath | ||
| Magnetic stirring bars | VWR | 442-4520 (EU) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030 120.086 (EU) | |
| Microscope | For the images in this protocol a Leica SP5 confocal microscope has been used | ||
| Na HEPES | Sigma | H7006 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| NaOH | Honeywell Fluka | 71686 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids | 850457 | Traded trough Sigma |
| Streptavidin | Sigma | S4762 | |
| tert-Butanol (2-methyl-2-propanol) | Honeywell Riedel-de Haën | 24127 | |
| Ultrapure water | e.g. MilliQ |
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