Cell-cell fusion av Genomredigerade cellinjer för perturbation av cellstruktur och funktion
Summary
Syftet med detta protokoll är att smälta samman två olika celltyper för att skapa hybridceller. Fluorescens mikroskopi analys av smält celler används för att spåra cellen ursprung cellulära organeller. Denna analys kan användas för att undersöka hur cellernas struktur och funktion reagerar på störning av Cellfusion.
Abstract
Livet är rumsligt partitionerad inom lipid membran för att möjliggöra isolerade bildandet av distinkta molekylära tillstånd inuti celler och organeller. Cellfusion är sammanslagningen av två eller flera celler för att bilda en enda cell. Här erbjuder vi ett protokoll för Cellfusion av två olika celltyper. Smält hybridceller berikas med flödescytometri-baserad sortering, följt av fluorescens mikroskopi av hybrid cellstruktur och funktion. Fluorescent taggade proteiner som genereras av genom redigering är avbildade inuti smält celler, så cellulära strukturer som skall identifieras baserat på fluorescensutsläpp och refereras tillbaka till celltypen av ursprung. Denna robusta och allmänna metod kan appliceras på olika celltyper eller organeller av intresse, att förstå cellulära struktur och funktion över en rad grundläggande biologiska frågor.
Introduction
Homeostatic underhåll av cellulära struktur är avgörande för livet. Celler har karakteristiska morfologier, sub-cellulära organell nummer, och interna biokemiska sammansättning. Förstå hur dessa grundläggande egenskaper genereras och hur de går snett under sjukdom kräver laboratorie verktyg för att stör dem.
Cell fusion är sammanslagningen av två eller flera separata celler. Cell fusion kan ha varit avgörande för uppkomsten av eukaryota liv1. I människokroppen, Cellfusion är relativt sällsynt, inträffar under begränsade utvecklingsförhållanden och vävnadstyper, såsom under befruktning eller bildandet av muskler, ben och moderkakan2. Detta protokoll beskriver induktion av cell-Cellfusion i vävnadsodling cellinjer med Differentiellt Fluorescent märkta organeller, som ett verktyg för att förstå de mekanismer som styr cellstruktur och funktion.
In vitro-inducerad cell-Cellfusion är central för produktionen av monoklonala antikroppar3, ett viktigt verktyg för biologisk forskning och sjukdomsbehandling. Cellfusion har också använts för att ställa många olika grundläggande cellbiologiska frågor om cell Cycle dominans4, aneuploidi5,6, cellulära omprogrammering7,8, reparation av skadade nervceller9, viral proliferation10, apoptos11, uppkomst12, cytoskeletala dynamik13, och membran fusion14,15. Laboratoriebaserade metoder för att inducera cell-Cellfusion16,17,18,19 inducera lipid membran återförening genom fysisk sammanslagning av två lipidmonolager till en. Cell fusion kan induceras av elektricitet18, viral baserade metoder17, termoplasmonic värme20, transgenens Expression19, och kemikalier inklusive polyetylenglykol (PEG)16,21,22.
Centrosomes är mikrotubuli organisera centra styra cellulära form, motilitet, polarisering, och Division23. Centrosomal rötter är fibrösa strukturer som sträcker sig från centrosomes innehåller proteinet rootletin24 (kodas av genen crocc). Vi använde nyligen cell-Cellfusion för att förstå hur centrosom position och antal varierar inuti heterokaryons i förhållande till föräldra celler24. Logiken bakom användningen av denna metod är att spåra cellen ursprung rötter inom en heterokaryon efter fusion av differentially Fluorescent taggade föräldra celler, och därmed bild organell fusion och fission. De Fluorescent taggade proteiner rootletin-meGFP eller rootletin-mScarlet-I skapas genom genom redigering i separata cellinjer som sedan smält genom PEG-medierad Cellfusion. Vi beskriver användningen av cell färgämnen (tabell över material) för att identifiera smält celler med flödescytometri och påföljande fluorescens-mikroskopi identifiering av centrosom cell ursprung och morfologi (figur 1). Detta tillvägagångssätt är en robust och unik metod för att studera hur stora förändringar i cellulära tillstånd inklusive organell antal inkräkta på cell homeostas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi visar ett facile och kostnadseffektivt protokoll för att fixera celler och visualisera den efterföljande arkitekturen av cell hybrider med mikroskopi, tar cirka två dagar från början till. Kritiska delar av detta protokoll är berikning av smält celler genom cell sortering (protokoll avsnitt 3), och noggrann validering av smält celler genom mikroskopi (protokoll avsnitt 4). Dessa avsnitt se till att smält celler är lätt erhållas och är bona fide heterokaryons. Koncentrationer och inkubationstider bör föl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av en Wellcome Trust Henry Wellcome Fellowship till R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant nummer 100090/12/Z). Finansiär hade ingen roll i studiens utformning, datainsamling och analys, beslut om att publicera eller förberedelse av manuskriptet. Vi tackar Ashok Venkitaraman och Paul French för kritisk rådgivning och vägledning om projektet. Vi tackar Chiara Cossetti och Gabriela Grondys-Kotarba i Cambridge Institutet för medicinsk forskning Flow Cytometry Facility för utmärkt stöd. Vi tackar Liam Cassiday, Thomas Miller och Gianmarco Contino för korrekturläsning av manuskriptet.
Materials
| 15 ml tube | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope | Carl Zeiss | ||
| 8-well imaging dishes | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cell Filters (70um) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 independent imaging medium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Phosphate buffered saline (1 x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L | ||
| Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polypropylene tubes | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nonionic surfactant |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nonionic detergent |
References
- Lane, N. . Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Rao, P. N., Johnson, R. T. Mammalian Cell Fusion: Studies on the Regulation of DNA Synthesis and Mitosis. Nature. 225 (5228), 159-164 (1970).
- Lengauer, C., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Genetic instability in colorectal cancers. Nature. 386 (6625), 623-627 (1997).
- Fournier, R. E., Ruddle, F. H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (1), 319-323 (1977).
- Tada, M., Tada, T., Lefebvre, L., Barton, S. C., Surani, M. A. Embryonic germ cells induce epigenetic reprogramming of somatic nucleus in hybrid cells. The EMBO Journal. 16 (21), 6510-6520 (1997).
- Skelley, A. M., Kirak, O., Suh, H., Jaenisch, R., Voldman, J. Microfluidic control of cell pairing and fusion. Nature Methods. 6 (2), 147-152 (2009).
- Donaldson, J., Shi, R., Borgens, R. Polyethylene glycol rapidly restores physiological functions in damaged sciatic nerves of guinea pigs. Neurosurgery. 50 (1), 147-157 (2002).
- Duelli, D. M., Hearn, S., Myers, M. P., Lazebnik, Y. A primate virus generates transformed human cells by fusion. The Journal of Cell Biology. 171 (3), 493-503 (2005).
- Duelli, D. M., Lazebnik, Y. A. Primary cells suppress oncogene-dependent apoptosis. Nature Cell Biology. 2 (11), 859-862 (2000).
- Duelli, D. M., et al. A virus causes cancer by inducing massive chromosomal instability through cell fusion. Current Biology. 17 (5), 431-437 (2007).
- Paramio, J. M., Casanova, M. L., Alonso, A., Jorcano, J. L. Keratin intermediate filament dynamics in cell heterokaryons reveals diverse behaviour of different keratins. Journal of Cell Science. 110, 1099-1111 (1997).
- Lentz, B. R. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. European Biophysics Journal. 36 (4-5), 315-326 (2007).
- Lentz, B. R., Lee, J. K. Poly(ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle release?. Molecular Membrane Biology. 16 (4), 279-296 (1999).
- Pontecorvo, G. Production of mammalian somatic cell hybrids by means of polyethylene glycol treatment. Somatic Cell Genetics. 1 (4), 397-400 (1975).
- Okada, Y. Analysis of giant polynuclear cell formation caused by HVJ virus from Ehrlich’s ascites tumor cells. I. Microscopic observation of giant polynuclear cell formation. Experimental Cell Research. 26, 98-107 (1962).
- Zimmermann, U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochimica et Biophysica Acta. 694 (3), 227-277 (1982).
- Hu, C., et al. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science. 300 (5626), 1745-1749 (2003).
- Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 9922, 992211 (2016).
- Kao, K. N., Michayluk, M. R. A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta. 115 (4), 355-367 (1974).
- Ahkong, Q. F., Fisher, D., Tampion, W., Lucy, J. A. Mechanisms of cell fusion. Nature. 253 (5488), 194-195 (1975).
- Mahen, R., Venkitaraman, A. R. Pattern formation in centrosome assembly. Current Opinion in Cell Biology. 24 (1), 14-23 (2012).
- Mahen, R. Stable centrosomal roots disentangle to allow interphase centriole independence. PLoS Biology. 16 (4), e2003998 (2018).
- Mahen, R., et al. Comparative assessment of fluorescent transgene methods for quantitative imaging in human cells. Molecular Biology of the Cell. 25 (22), 3610-3618 (2014).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Yang, J., Shen, M. H. Polyethylene glycol-mediated cell fusion. Methods in Molecular Biology. 325, 59-66 (2006).
- Huang, L., Chen, Y., Huang, W., Wu, H. Cell pairing and polyethylene glycol (PEG)-mediated cell fusion using two-step centrifugation-assisted single-cell trapping (CAScT). Lab on a Chip. 18 (7), 1113-1120 (2018).
- Feliciano, D., Nixon-Abell, J., Lippincott-Schwartz, J. Triggered Cell-Cell Fusion Assay for Cytoplasmic and Organelle Intermixing Studies. Current Protocols in Cell Biology. 81 (1), e61 (2018).
- Vaughan, V. L., Hansen, D., Stadler, J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell fusion and hybridization in lymphoid cell lines. Somatic Cell Genetics. 2 (6), 537-544 (1976).
- Frye, L. D., Edidin, M. The rapid intermixing of cell surface antigens after formation of mouse-human heterokaryons. Journal of Cell Science. 7 (2), 319-335 (1970).
- Mattenberger, Y., James, D. I., Martinou, J. C. Fusion of mitochondria in mammalian cells is dependent on the mitochondrial inner membrane potential and independent of microtubules or actin. FEBS Letters. 538 (1-3), 53-59 (2003).
- Kerbel, R. S., Lagarde, A. E., Dennis, J. W., Donaghue, T. P. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. Molecular and Cellular Biology. 3 (4), 523-538 (1983).
