細胞構造と機能の摂動のためのゲノム編集細胞株の細胞融合
Summary
このプロトコルの目的は、2 つの異なるセルタイプを融合してハイブリッドセルを作成することです。融合細胞の蛍光顕微鏡分析は、細胞オルガネラの起源の細胞を追跡するために使用されます。このアッセイは、細胞の構造と機能が細胞融合による摂動にどのように反応するかを調べるために使用できます。
Abstract
生命は、細胞およびオルガネラの中の異なる分子状態の単離された形成を可能にするために、脂質膜内で空間的に分配される。細胞融合は、2つ以上の細胞を合併して単一の細胞を形成する。ここでは、2種類の異なる細胞融合のためのプロトコルを提供する。融合したハイブリッド細胞は、フローサイトメトリーベースのソーティングによって濃縮され、続いてハイブリッド細胞構造と機能の蛍光顕微鏡検査が行われる。ゲノム編集によって生成された蛍光タグ付きタンパク質は、融合細胞内で画像化され、蛍光発光に基づいて細胞構造を同定し、細胞の起源型に逆戻りすることができます。この堅牢で一般的な方法は、興味のある異なる細胞タイプまたはオルガネラに適用することができ、基本的な生物学的問題の範囲にわたって細胞構造および機能を理解する。
Introduction
細胞構造の恒静維持は生命にとって重要である。細胞は、特徴的な形態、細胞下オルガネラ数、および内部生化学組成物を有する。これらの基本的な特性がどのように生成され、病気の間にどのように苦労するかを理解するには、それらを摂動するための実験室ツールが必要です。
細胞融合は、2つ以上の別個の細胞の融合である。細胞融合は真核生物1の出現に重要であったかもしれない。人体において、細胞融合は比較的稀であり、受精中や筋肉、骨および胎盤2の形成中などの発達の制限された状況および組織型の間に起こる。このプロトコルは、細胞の構造および機能を制御するメカニズムを理解するツールとして、微分蛍光標識オルガネラを有する組織培養細胞株における細胞融合の誘導を記述する。
インビトロ誘導細胞融合は、モノクローナル抗体3の産生の中心であり、生物学的研究および疾患治療のための重要なツールである。細胞融合はまた、細胞周期優位性に関する多くの異なる基本的な細胞生物学的質問を尋ねるために使用されてきた, アネプロイド5,6, 細胞リプログラミング7,8, 損傷ニューロンの修復9, ウイルス増殖10, アポトーシス11, 腫瘍形成12, サイト骨格ダイナミクス13, および膜融合14,15.細胞融合16、17、18、19を誘導する実験室ベースの方法は、2つの二重層を1つに物理的に結合させることによって脂質膜合体を誘導する。細胞融合は、電気18、ウイルスベースの方法17、サーモプラズモン加熱20、トランスジーン発現19、およびポリエチレングリコール(PEG)16、21、22を含む化学物質によって誘導され得る。
セントロソームは、細胞形状、運動性、偏光、および分裂23を制御する微小管組織化センターである。心分離根は、タンパク質ルートレットイン24を含むセントロソーム(遺伝子CROCCによってコードされる)から延びる線維構造である。我々は最近、細胞融合を用いて、親細胞24に対するヘテロコン内の重心の位置と数がどのように変化するかを理解した。この方法の使用の背後にある根拠は、微分蛍光タグ付き親細胞の融合後にヘテロカリオン内の根の起源の細胞を追跡し、したがって、オルガネラ融合と核分裂を画像化することです。蛍光タグ付きタンパク質のルートレチン-meGFPまたはルートレチン-mScarlet-Iは、PEG媒介細胞融合によって融合された別々の細胞株でゲノム編集によって作成されます。細胞染色体(材料表)を用いて、フローサイトメトリーおよびその後の蛍光顕微鏡による起源および形態のセントロソーム細胞の同定によって融合細胞を同定する(図1)。このアプローチは、オルガネラ数を含む細胞状態の大きな変化が細胞恒常性にどのように影響するかを研究するための堅牢でユニークな方法です。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞を融合し、その後の細胞ハイブリッドのアーキテクチャを顕微鏡で可視化し、開始から終了まで約2日を要する、ファシリティで費用対効果の高いプロトコルを実証します。このプロトコルの重要な部分は、細胞選別による融合細胞の濃縮(プロトコルセクション3)、および顕微鏡による融合細胞の慎重な検証(プロトコルセクション4)である。これらのセクションは、融合された細胞が容易…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ウェルカム・トラスト・ヘンリー・ウェルカム・フェローシップからR.M.(https://wellcome.ac.uk/grant番号100090/12/Z)によって資金提供されました。この受け手は、研究デザイン、データ収集・分析、出版決定、原稿の作成には何の役割も持っていなかった。アショク・ヴェンキタラマンとポール・フレンチは、このプロジェクトに関する重要なアドバイスとガイダンスに感謝します。ケンブリッジ医学研究所のキアラ・コセッティとガブリエラ・グロンディス・コタルバに感謝し、優れたサポートを提供しています。リアム・カッシデイ、トーマス・ミラー、ジャンマルコ・コンティーノの原稿を校正してくれてありがとう。
Materials
| 15 ml tube | Sarstedt | 62554502 | |
| 37% formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope | Carl Zeiss | ||
| 8-well imaging dishes | Ibidi | 80826 | |
| Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cell Filters (70um) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-At565 | |
| L15 CO2 independent imaging medium | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich | 15140122 | |
| Phenol red free DMEM, high glucose | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| Phosphate buffered saline (1 x PBS) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L | ||
| Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| Polypropylene tubes | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | nonionic surfactant |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | nonionic detergent |
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