Summary

Fusion cellulaire du génome Lignes cellulaires modifiées pour la perturbation de la structure et de la fonction cellulaires

Published: December 07, 2019
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Summary

Le but de ce protocole est de fusionner deux types de cellules différents pour créer des cellules hybrides. L’analyse de microscopie de fluorescence des cellules fusionnées est employée pour suivre la cellule d’origine des organites cellulaires. Cet analyse peut être utilisé pour explorer comment la structure cellulaire et la fonction réagissent à la perturbation par fusion cellulaire.

Abstract

La vie est spatialement cloisonnée dans les membranes lipidiques pour permettre la formation isolée d’états moléculaires distincts à l’intérieur des cellules et des organites. La fusion cellulaire est la fusion de deux cellules ou plus pour former une seule cellule. Ici, nous fournissons un protocole pour la fusion cellulaire de deux types de cellules différentes. Les cellules hybrides futilisées sont enrichies par le tri à base de cytométrie de flux, suivi de la microscopie de fluorescence de la structure et de la fonction des cellules hybrides. Les protéines étiquetées fluorescentes générées par l’édition du génome sont représentées à l’intérieur de cellules fusionnées, ce qui permet d’identifier les structures cellulaires en fonction de l’émission de fluorescence et de les référencer au type d’origine cellulaire. Cette méthode robuste et générale peut être appliquée à différents types de cellules ou organites d’intérêt, pour comprendre la structure cellulaire et la fonction à travers une gamme de questions biologiques fondamentales.

Introduction

L’entretien homéostatique de la structure cellulaire est essentiel à la vie. Les cellules ont des morphologies caractéristiques, des nombres d’organites sous-cellulaires et une composition biochimique interne. Comprendre comment ces propriétés fondamentales sont générées et comment elles tournent mal pendant la maladie nécessite des outils de laboratoire pour les perturber.

La fusion cellulaire est la fusion de deux ou plusieurs cellules distinctes. La fusion cellulaire peut avoir été essentielle à l’émergence de la vie eucaryote1. Dans le corps humain, la fusion cellulaire est relativement rare, se produisant pendant les circonstances de développement restreintes et les types de tissu, tels que pendant la fécondation ou la formation du muscle, de l’os et du placenta2. Ce protocole décrit l’induction de la fusion cellule-cellule dans les lignées cellulaires de culture de tissu avec les organites fluorescents différentiellement, comme outil pour comprendre les mécanismes contrôlant la structure et la fonction de cellules.

La fusion cellulaire induite in vitro est au cœur de la production d’anticorps monoclonaux3, un outil important pour la recherche biologique et le traitement des maladies. La fusion cellulaire a également été utilisée pour poser de nombreuses questions biologiques fondamentales différentes sur la dominance du cycle cellulaire4, aneuploidy5,6, reprogrammation cellulaire7,8, la réparation des neurones endommagés9, prolifération virale10, apoptose11, tumorigenesis12, dynamique cytosquelettique13, et fusion membranaire14,15. Méthodes basées en laboratoire pour induire la fusion cellule-cellule16,17,18,19 induire la coalescence de membrane lipidique par la fusion physique de deux bicouches en un seul. La fusion cellulaire peut être induite par l’électricité18, les méthodes virales17, chauffage thermoplasmonique20, expression transgène19, et les produits chimiques, y compris le polyéthylène glycol (PEG)16,21,22.

Les centrosomes sont des centres d’organisation de microtubules contrôlant la forme cellulaire, la motilité, la polarisation, et la division23. Les racines centrosomal sont des structures fibreuses s’étendant des centrosomes contenant la racine de protéine24 (encodée par le gène CROCC). Nous avons récemment utilisé la fusion cellule-cellule pour comprendre comment la position centrosome et le nombre varie à l’intérieur des hétérodaryons par rapport aux cellules parentales24. La raison d’être de cette méthode est de suivre la cellule d’origine des racines dans un hétérookaryon après la fusion de cellules parentales étiquetées différemment fluorescentes, et donc d’imager la fusion et la fission organelle. Les protéines fluorescentes taguées rootletin-meGFP ou rootletin-mScarlet-I sont créées par l’édition du génome dans des lignées cellulaires séparées qui sont ensuite fusionnées par la fusion cellulaire médiée par PEG. Nous décrivons l’utilisation de colorants cellulaires (Tableau des matériaux) pour identifier les cellules fusionnées par cytométrie d’écoulement et identification subséquente de microscopie de fluorescence de la cellule centrosome d’origine et de la morphologie (figure 1). Cette approche est une méthode robuste et unique pour étudier comment les changements majeurs dans l’état cellulaire, y compris le nombre d’organelles empiéter sur l’homéostasie cellulaire.

Protocol

1. Étiquetage différentiel des cellules fluorescentes Marquage génétique avec CRISPR Cas9 Utilisez l’édition du génome CRISPR Cas9 pour étiqueter la racine (ou d’autres gènes d’intérêt) avec les protéines fluorescentes meGFP ou mScarlet-I dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines.REMARQUE: Les protocoles détaillés pour l’édition du génome sont couverts ailleurs24,25,26</s…

Representative Results

Les cellules correctement étiquetées sont visibles pendant la cytométrie d’écoulement par signal de fluorescence plus élevé que les cellules témoins non étiquetées (figure 2A). Les portes sont fixées pour le tri des cellules double ment positives, enrichissant cette population directement dans des plats d’imagerie pour d’autres analyses microscopiques. Les cellules futilisées sont détectables en tant que cellules distinctes à dou…

Discussion

Nous démontrons un protocole facile et rentable pour fusionner des cellules et visualiser l’architecture suivante des hybrides cellulaires avec la microscopie, prenant approximativement deux jours du début à la fin. Les parties critiques de ce protocole sont l’enrichissement des cellules fusionnées par tri cellulaire (section 3 du protocole) et la validation soigneuse des cellules fusionnées par microscopie (section 4 du protocole). Ces sections s’assurent que les cellules fusionnées sont facilement obtenues et son…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par une bourse Wellcome Trust Henry Wellcome à R.M. (https://wellcome.ac.uk/grant numéro 100090/12/Z). Le bailleur de rôle n’a joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit. Nous remercions Ashok Venkitaraman et Paul Français pour les conseils et les conseils essentiels sur le projet. Nous remercions Chiara Cossetti et Gabriela Grondys-Kotarba du Cambridge Institute for Medical Research Flow Cytometry pour leur excellent soutien. Nous remercions Liam Cassiday, Thomas Miller et Gianmarco Contino d’avoir relu le manuscrit.

Materials

15 ml tube Sarstedt 62554502
37% formaldehyde solution Sigma-Aldrich F8875
880 Laser Scanning Confocal Airyscan Microscope Carl Zeiss
8-well imaging dishes Ibidi 80826
Anti-GFP alpaca GFP booster nanobody Chromotek gba-488
BD Influx Cell Sorter BD Biosciences
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
Cell Filters (70um) Biofil CSS010070
CellTrace Far Red ThermoFisher Scientific C34572
CellTrace Violet ThermoFisher Scientific C34571
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate ThermoFisher Scientific 31966021
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 10270-106
FluoTag-X2 anti-mScarlet-I alpaca nanobody NanoTag Biotechnologies N1302-At565
L15 CO2 independent imaging medium Sigma-Aldrich 21083027
Penicillin/streptomycin Sigma-Aldrich 15140122
Phenol red free DMEM, high glucose ThermoFisher Scientific 21063029
Phosphate buffered saline (1 x PBS) 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2HPO4, dH2O up to 1L
Polyethylene Glycol Hybri-Max 1450 Sigma-Aldrich P7181
Polypropylene tubes BD Falcon 352063
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151 nonionic surfactant
Trypsin Sigma-Aldrich T4049
Tween 20 Fisher BioReagents BP337 nonionic detergent

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Cite This Article
Mahen, R., Schulte, R. Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function. J. Vis. Exp. (154), e60550, doi:10.3791/60550 (2019).

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